于 紅 邢 軍 張 瑞*

1.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 新疆烏魯木齊 8300542.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆烏魯木齊 830046

骨骼肌是脊椎動(dòng)物中一種復(fù)雜的動(dòng)態(tài)組織，主要分布在脊椎動(dòng)物的背部、腹部以及四肢等部位。其中骨骼肌的主體部分主要分布在肌腹部位，色澤紅艷且具有收縮能力，存在較高的可塑性。揭示骨骼肌肌肉生長發(fā)育機(jī)制,并建立體外培養(yǎng)模型,是研究如何提高該肉畜的產(chǎn)肉性能與肉質(zhì)重中之重。雖然骨骼肌主要由具有核分裂后核的多核纖維組成，但它在受到損傷事件的反應(yīng)中，具有顯著的再生能力。骨骼肌的再生潛力依賴于衛(wèi)星細(xì)胞的活動(dòng)，即與肌纖維密切相關(guān)的肌內(nèi)單核細(xì)胞。Teng[1](2015)等研究發(fā)現(xiàn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化和融合是一個(gè)協(xié)調(diào)的多步驟過程，對(duì)骨骼肌的發(fā)展和再生及損傷修復(fù)都至關(guān)重要。Forcina[2](2018)等研究發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星細(xì)胞通常處于靜止?fàn)顟B(tài)，激活后會(huì)進(jìn)入細(xì)胞周期，與已存在的肌纖維相互融合維持干細(xì)胞池，以保證一個(gè)有效的細(xì)胞轉(zhuǎn)換；然而，當(dāng)肌肉受到損傷時(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞的活動(dòng)能力會(huì)受到環(huán)境的刺激而增加，開始大量分裂、增殖并相互融合形成肌管，進(jìn)而形成新的肌纖維，參與肌肉組織的再生；從而改善相關(guān)畜禽的肉制品嫩度及口感，影響肉品質(zhì)的食品安全。

1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞與肉品質(zhì)的關(guān)系

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞能通過細(xì)胞被激活，增殖分化為成熟肌細(xì)胞，然后融合已存在的肌纖維，保證一個(gè)有效的細(xì)胞轉(zhuǎn)換，進(jìn)而影響肌纖維增值分化的整個(gè)過程。骨骼肌細(xì)胞增殖分化形成的肌纖維組織結(jié)構(gòu)和數(shù)量大小，同樣也是決定肉用動(dòng)物肉質(zhì)好壞的重要因素。由此可知，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的生長發(fā)育情況與肉品質(zhì)也同樣存在密切的相關(guān)性，通過研究骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的發(fā)育改善肉品質(zhì)，已成為了肉品質(zhì)研究的新方向。Davis[3](2020)等研究發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星細(xì)胞是最佳肌肉生長所必需的，并且可能在協(xié)調(diào)有效的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以適應(yīng)運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮作用。

1.1 骨骼肌細(xì)胞的生長與發(fā)育

脊椎動(dòng)物骨骼肌(skeletal muscle)生長和發(fā)育的調(diào)控過程都非常的精密。骨骼肌在神經(jīng)管兩側(cè)的近軸中胚層區(qū)聚集成肌節(jié)，而生成骨骼肌的肌節(jié)質(zhì)細(xì)胞是單核細(xì)胞，通常呈紡錘形或者雙極形，還有一些形狀上如成纖維的細(xì)胞，也會(huì)分化為成肌細(xì)胞(myoblast)[4]。成肌細(xì)胞通過細(xì)胞間的融合作用，產(chǎn)生使肌肉并最終相互融合形成肌管(myotube)，隨后單個(gè)細(xì)胞核附著在肌管的表面，并分化形狀多為扁平梭型，且細(xì)胞體積較小的骨骼肌的肌衛(wèi)星細(xì)胞(muscle satellite cell)。

最近Yimi[5](2020)研究確認(rèn)，動(dòng)物骨骼肌細(xì)胞的主要來源是肌衛(wèi)星細(xì)胞。肌衛(wèi)星細(xì)胞作為一種肌源性干細(xì)胞存在成年骨骼肌內(nèi)，隨后經(jīng)過一系列的增殖和終末分化過程，形成成肌細(xì)胞，最后成肌細(xì)胞可以轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌N類的快慢肌纖維[6]。一般來說，大多數(shù)肉用動(dòng)物的肌肉中都會(huì)有4種不同的肌纖維類型，即緩慢氧化型(I型)、快速氧化糖酵解型(IIA型)和快速糖酵解型(IIX型)和IIB型[7]，它們?cè)诓煌∪庵械南鄬?duì)組成可以決定肌肉代謝特性的優(yōu)勢(shì)[8]。在骨骼肌轉(zhuǎn)化過程中的存在很多起到重要調(diào)控作用的基因，分別在不同發(fā)育階段，對(duì)復(fù)雜多變的方式進(jìn)行相應(yīng)的組合，最終形成一系列信號(hào)通路系統(tǒng)。目前，科學(xué)家們已經(jīng)鑒定出了多種與肌肉發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。不同的肌肉有其獨(dú)特的內(nèi)在肌肉纖維類型和分布，這導(dǎo)致不同的代謝模式、生理過程和肉質(zhì)屬性，進(jìn)而決定肉品質(zhì)的好壞。

1.2 肌纖維與肉品質(zhì)的關(guān)系

許多研究報(bào)道了肉品質(zhì)特性和纖維結(jié)構(gòu)類型之間的關(guān)系，表明肌肉纖維特性很大程度上決定了肉的品質(zhì)，因此近幾年研究者欲通過操縱肌肉纖維特性來改善肉的品質(zhì)。評(píng)定肉品質(zhì)的指標(biāo)主要包括肉色評(píng)分、持水性、硬度、彈性、蛋白質(zhì)含量、咀嚼性等[9]。在肌纖維發(fā)育過程中，肉品質(zhì)特性隨著肌纖維特性變化也在發(fā)生著變化。烏日罕[10](2018)相關(guān)研究表明，通過改變肌纖維特性影響肌肉的嫩度主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面是改變肌纖維直徑大小，另一方面是改變肌內(nèi)脂肪含量。肌纖維直徑包括Ⅰ型和Ⅱb型兩種類型，Ⅰ型肌纖維直徑小較細(xì)，會(huì)降低肌肉的剪切力，有助于提高肉品的嫩度；Ⅱb型的肌纖維橫截面積較大，會(huì)降低肉質(zhì)的嫩度。

與此同時(shí)，肌纖維的組成與分布情況也同樣是影響肉質(zhì)好壞的關(guān)鍵因素。酵解型肌纖維的高含量會(huì)降低肌肉的持水性能力[11]，肌肉氧化能力同樣是一種重要的內(nèi)在肌肉因素，可以控制肉的顏色，源自于肉表面的肌紅蛋白色素與氧氣接觸，脫氧肌紅蛋白從紫色到紅色，最后到棕色的肌紅蛋白。在肌肉中含有較高M(jìn)yHCⅠ型、MyHCⅡa型時(shí)，肉色呈紅色，在肌肉中MyHCⅡb型占比例較多時(shí)，則外觀蒼白。對(duì)于剛出生的動(dòng)物，紅白肌纖維的組成區(qū)別不大，但是隨著動(dòng)物年齡的生長，紅肌纖維含量也隨之增加肉質(zhì)較好。

綜上所述，影響動(dòng)物肌肉的生長及肉品質(zhì)因素，從根本上取決于肌纖維類型與組成。也有相關(guān)研究表明，增加豬長臀肌中快速收縮糖酵解纖維的比例，可以提高肉質(zhì)中pH值下降的速度和程度。因此，Ⅱb型肌纖維比例的增加必然導(dǎo)致肌肉的增長。就肉質(zhì)而言，了解肌肉纖維特性與肉質(zhì)特性之間的關(guān)系，將有助于提高肉質(zhì)的產(chǎn)量。

1.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞與肌纖維的關(guān)系

肌纖維的類型、組成成分、數(shù)量大小直接調(diào)控著哺乳動(dòng)物的肉品質(zhì)，而肌纖維的生長情況直接取決于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化能力。研究中經(jīng)常通過兩步酶消化和反復(fù)差速貼壁法分離純化得到了純度較高的衛(wèi)星細(xì)胞,此后細(xì)胞延展并開始快速增殖。通過增殖、遷徙肌衛(wèi)星細(xì)胞融合進(jìn)已存在的肌纖維中，來誘導(dǎo)肌纖維的肥大，從而促進(jìn)肌肉生長。與此同時(shí)，秦本源[12](2020)研究表明，由于骨骼肌駐留干細(xì)胞肌肉衛(wèi)星細(xì)胞(MuSCs)的活性，肌肉衛(wèi)星細(xì)胞具有優(yōu)異的再生能力。Fukada[13](2020)研究表明，肌纖維大小對(duì)外界刺激、內(nèi)在因素或身體活動(dòng)的適應(yīng)，這被稱為可塑性。低體力活動(dòng)和一些疾病會(huì)導(dǎo)致肌纖維尺寸減小，稱為萎縮，而肥大指的是高體力活動(dòng)或合成代謝激素/藥物引起的肌纖維尺寸增加。

骨骼肌的再生潛能依賴于衛(wèi)星細(xì)胞的活動(dòng)。通常情況下，衛(wèi)星細(xì)胞在它們的層下位置保持靜止?fàn)顟B(tài)，偶爾進(jìn)入細(xì)胞周期，通過融合已存在的肌纖維，以保證細(xì)胞間的有效轉(zhuǎn)化。然而，在肌肉損傷后，隨著環(huán)境刺激的增加，衛(wèi)星細(xì)胞的活動(dòng)大大增加，從而參與了功能性肌肉組織的再生[14]。脊椎動(dòng)物中成肌細(xì)胞融合一般包含兩個(gè)階段。第一階段，新生肌管的形成取決于單核成肌細(xì)胞相互融合；第二階段，是新生肌管互相融合或新生肌管與單核成肌細(xì)胞融合產(chǎn)生成熟肌管，最終發(fā)育形成成熟的肌纖維。按照肌纖維的氧化、收縮、代謝及MyHC(Myosinheavychains)異構(gòu)體表達(dá)等特性，肌纖維可分為慢速氧化型肌纖維(I型)、快速氧化型(Ⅱa型)、快速酵解型(Ⅱb型)、中間型(Ⅱx型)4種類型。其中I型纖維的線粒體數(shù)目較多但糖原較少，因此具有較高的氧化能力和ATP消耗速率導(dǎo)致I型纖維具有較低的糖酵解潛力，有相關(guān)研究建立快慢速性肌肉成肌細(xì)胞培養(yǎng)模型，用于研究肌肉生長發(fā)育[15]。此外，I型肌纖維的脂質(zhì)含量較高、纖維直徑較大，因此該型肌纖維的肌內(nèi)脂肪含量和剪切力較高。由于骨骼肌主要由肌纖維組成，鮮肉的品質(zhì)與肌纖維特性直接相關(guān)，通過提高I型肌纖維在肌肉中的比例將可能有效地改善畜禽的肉品質(zhì)。

研究發(fā)現(xiàn)，在骨骼肌分化過程中，融入肌纖維形成了新的肌核，所以衛(wèi)星細(xì)胞隨著肌纖維生長發(fā)育而逐漸減少。肌纖維組織學(xué)特征可以保持相對(duì)恒定的原因是由于在肌纖維達(dá)到成熟期時(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞將處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)。蘇琳[16](2014)等對(duì)蘇尼特羊股二頭肌的肌纖維特性與肉品質(zhì)相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)，蘇尼特羊隨著肌纖維密度的增加，粗脂肪隨之增加而剪切力隨之減小，且也發(fā)現(xiàn)其中ⅡB型肌纖維比例最高。肌衛(wèi)星細(xì)胞的含量和異質(zhì)性是調(diào)控品種間和組織間肌纖維構(gòu)成不同的關(guān)鍵因素[17]。因此可得出結(jié)論，肌纖維的發(fā)育與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量、增殖和分化能力在哺乳動(dòng)物的整個(gè)生命周期中起著重要作用。

2 影響SMSCs增殖分化的因子PHam

在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的生成發(fā)育過程中，經(jīng)過一系列形態(tài)、細(xì)胞和分子生物學(xué)方面的變化，最后通過終端分化形成了多樣性的成肌細(xì)胞，最終分化為多種類型的快、慢肌纖維。這些變化的基本前提是一系列基因在轉(zhuǎn)錄水平上精確表達(dá)調(diào)控，而這些調(diào)控在某一時(shí)期以及某一特定的發(fā)育階段，各種轉(zhuǎn)錄因子以多種多樣的方式進(jìn)行特定的組合，形成了多種形式信息組成的復(fù)雜的信號(hào)通道系統(tǒng)而進(jìn)行精確的調(diào)控。參與調(diào)控這一過程的因子主要包括Id(DNA結(jié)合抑制子)、Pax-3蛋白、肌肉調(diào)節(jié)因子MRFs(MyoD、Myf5、Myogenin及MRF4)、MEF2(肌細(xì)胞增強(qiáng)因子)等。

2.1 Pax因子

目前研究表明，PAX基因家族在進(jìn)化上高度保守，人和小鼠的PAX基因有9種(PAX1-PAX90)，每個(gè)都有自己的生物學(xué)功能。實(shí)驗(yàn)證明，出生后骨骼肌細(xì)胞的增殖和再生，主要依賴于成體干細(xì)胞——衛(wèi)星細(xì)胞。衛(wèi)星細(xì)胞的特點(diǎn)是配對(duì)盒轉(zhuǎn)錄因子PAX7的表達(dá)。有報(bào)道顯示在C57/BL6小鼠中，用蘿卜硫素(SF)處理衛(wèi)星細(xì)胞樣(C2C12細(xì)胞)，在增殖和分化(即肌管/肌纖維的形成)過程中激活Nrf2/抗氧化信號(hào)，可導(dǎo)致了MyoD，PAX7，MyH2的表達(dá)減少，進(jìn)而影響肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化[18]。在衛(wèi)星細(xì)胞的存活、增殖等過程中，PAX7因子充當(dāng)著不可或缺的作用，且在衛(wèi)星細(xì)胞中的持續(xù)表達(dá)中可推遲肌肉發(fā)育的生成。相關(guān)研究表明，敲除PAX7和其同源物PAX3的基因，會(huì)造成肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為軟骨或其它類型的細(xì)胞甚至死亡。兩者都能夠激活骨骼肌轉(zhuǎn)錄因子上游MyoD基因的表達(dá)啟動(dòng)肌肉生成。PAX7在衛(wèi)星細(xì)胞從增殖到分化的過渡階段，通過控制MyoD基因的表達(dá)，防止肌細(xì)胞生成素基因的誘導(dǎo)和肌肉的過早分化。雖然PAX3與PAX7的有些功能在骨骼肌發(fā)育過程中相似，但是由衛(wèi)星細(xì)胞介導(dǎo)的骨骼肌再生的過程中，PAX3卻不能替代PAX7。在衛(wèi)星細(xì)胞被激活后，PAX3也不能代替PAX7的抗凋亡作用。

2.2 生肌調(diào)節(jié)因子家族(Myogenicregulatoryfactors,MRFs)PH

肌肉調(diào)節(jié)因子家族(muscleregulatoryfactors，MRFs)又稱為生肌決定因子(MyoD)基因家族，在骨骼肌生長發(fā)育的過程中，起著激活與調(diào)控肌細(xì)胞的增殖和分化的作用。生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族包括MyoD、MyoG、Myf5和Myf6這4種肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子，肌細(xì)胞的增殖和分化由肌肉調(diào)節(jié)因子控制著，這些調(diào)控因子與肌纖維的數(shù)量和大小也有密切關(guān)系，進(jìn)而對(duì)肉質(zhì)和風(fēng)味也起著非常重要的作用[19]。這些調(diào)節(jié)因子可以激活肌肉特異性的轉(zhuǎn)錄，是骨骼肌細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵機(jī)制。高玲[20](2015)等研究表明，Myf5和Myf6兩種突變類型與肌內(nèi)脂肪含量，大理石花紋，系水力和嫩度有較大相關(guān)性。此外，Myf4基因的突變與肉的嫩度和系水力有較大相關(guān)性[21]。

在肌細(xì)胞生長發(fā)育過程中，MyoD基因既能夠把處于靜止期的不同類型細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉〖?xì)胞，又能加強(qiáng)成肌細(xì)胞融合并分化為成熟的肌纖維的能力。任霆[22](2014)，Bongiorni[23](2014)等研究表明，MRFs家族成員表達(dá)順序首先是Myf5，其次幾乎同時(shí)表達(dá)MyoD和MyoG，最后當(dāng)肌管成熟時(shí)表達(dá)Myf6。MRFs基因家族作為調(diào)節(jié)骨骼肌的關(guān)鍵基因，與肌纖維的類型、組稱、含量以及家畜的產(chǎn)肉能力、肉品質(zhì)及風(fēng)味都有著相關(guān)性，被公認(rèn)為影響肉質(zhì)性狀的重要候選基因。

2.3 成肌增強(qiáng)因子(Myoccytespecific-enhancerfactor2,MEF2)

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子又稱成肌增強(qiáng)因子，屬于MADS超家族(Myocytespecifific-enhancerfactor2，MEF2)，廣泛存在于多種生物中。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，MEF2基因家族有4個(gè)成員：MEF2A，MEF2B，MEF2C，MEF2D下，而在肌肉發(fā)育過程中起到重要作用的是MEF2A。此外，也有相關(guān)研究鑒定出，兩個(gè)關(guān)鍵基因肌鈣蛋白T1(TNNT1)和肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈9(MYL9)在骨骼肌的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[24]。

2.4 負(fù)調(diào)控因子(Myostatain,MSTN)

肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)，又稱為生長分化因子8(GDF-8)，是轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforminggrowthfactor-β，TGF-β)超家族的成員之一，是骨骼肌生長和發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，主要抑制成肌細(xì)胞的增殖。相關(guān)研究表明，突變小鼠骨骼肌肥大是因?yàn)榧〖?xì)胞數(shù)量的增生和肌纖維的肥大，從而得知MSTN對(duì)于骨骼肌生長發(fā)育而言是一種具有負(fù)調(diào)控功能的基因。后來學(xué)者將該基因命名為肌肉生長抑制素(Myostatin)即MSTN基因，MSTN基因突變而導(dǎo)致的一種雙肌現(xiàn)象。雙肌性狀是因?yàn)镸STN基因發(fā)生了兩處突變：第一處是發(fā)生在外顯子1中的堿基C替換為A，導(dǎo)致苯丙氨酸被亮氨酸代替；第二處發(fā)生在外顯子3中，堿基G替換成A，導(dǎo)致色氨酸替代半胱氨酸，導(dǎo)致MSTN的功能受到了抑制。高麗[25](2016)等對(duì)非雙肌牛MSTN基因的分析表明，該基因的突變是造成雙肌現(xiàn)象的重要原因之一，基因突變的牛會(huì)出現(xiàn)雙肌癥狀，肌纖維肥大，肌肉量顯著增加，皮下脂肪減少，肌間脂肪增多，肉質(zhì)香嫩。

Ohtsubo[26](2017)等研究發(fā)現(xiàn)APOBEC2也是肌肉再生中成肌細(xì)胞分化的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。相關(guān)研究證實(shí)，apoB mRNA編輯酶能夠催化多肽家族成員APOBEC2的缺失，最終導(dǎo)致肌肉質(zhì)量減少，肌纖維增加，核位于中心，造成肉用動(dòng)物的營養(yǎng)不良。而且APOBEC2在骨骼肌和心肌中作為主要表達(dá)，僅僅在野生型成肌細(xì)胞培養(yǎng)的早期分化階段表達(dá)升高。對(duì)小鼠中的APOBEC2基因進(jìn)行敲除，結(jié)果顯示，成肌細(xì)胞培養(yǎng)的原代肌管形態(tài)正常，融合指數(shù)在成肌細(xì)胞早期升高，與此同時(shí)，肌球蛋白重鏈(MyHC)、肌原蛋白及其協(xié)同因子MEF2C表達(dá)水平也隨之升高。

2.5 其他影響因子

Horibata[27](2020)等利用小鼠成肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞和人類原代成肌細(xì)胞研究了磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移蛋白(StarD7)在骨骼成肌細(xì)胞分化中的作用。將蛋白重新導(dǎo)入StarD7敲除C2C12細(xì)胞后，線粒體PC水平和耗氧率的降低、myomaker、myomerger和PGC-1的低表達(dá)以及肌原性分化受損均得到完全恢復(fù)，結(jié)果表明StarD7在哺乳動(dòng)物骨骼肌生成中起重要作用。Zhang Ruimen[28](2020)等將角鯊烯環(huán)氧苷酶(Squalene epoxidase,SQLE)過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛骨骼肌源性間充質(zhì)干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)，研究SQLE通過肌發(fā)生調(diào)節(jié)肉質(zhì)的分子機(jī)制。分析了SQLE在牛胚胎和成年、4個(gè)不同牛品種的肌肉組織和廣西牛品種的11個(gè)不同組織、器官中的表達(dá)。結(jié)果表明，牛SQLE基因在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，在成年肌肉組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于胚胎期。尤其在細(xì)胞分化階段，SQLE表達(dá)明顯上調(diào)。此外，增殖、細(xì)胞周期、凋亡和成肌細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)表明，SQLE顯著促進(jìn)牛骨骼肌源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分化和凋亡，但抑制其增殖。研究揭示了SQLE在成肌細(xì)胞分化中的作用。此外，有研究圍繞Lnc247對(duì)骨骼肌再生過程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Foxk1的作用及對(duì)骨骼肌損傷修復(fù)的影響進(jìn)行了研究。沈浩[29](2019)研究結(jié)果顯示過表達(dá)Lnc247對(duì)Foxk1基因的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用，即Lnc247的表達(dá)能夠促進(jìn)受損肌纖維的肌源性分化，加快骨骼肌損傷修復(fù)的過程。說明骨骼肌在損傷后需要更多的能量和物質(zhì)的合成來修復(fù)受損的肌纖維。

3 RNAi與骨骼肌細(xì)胞

3.1 RNAi的介紹

RNA干擾(RNAinterference)是雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的特異性基因表達(dá)沉默現(xiàn)象。該作用是通過靶向降解mRNA或阻止mRNA翻譯為蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)基因沉默，在食品安全評(píng)價(jià)方面起著重要作用[30]。隨著人們對(duì)基因生物學(xué)功能研究的深入，RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用，也已延伸到功能基因組和人類疾病基因治療的相關(guān)研究中。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)將為基因組等方面的研究提供一條新的途徑[31]。

3.2 在哺乳動(dòng)物中應(yīng)用RNAi技術(shù)的主要策略

大量研究證實(shí)，利用基因沉默的酶學(xué)機(jī)制——RNAi機(jī)制，在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行穩(wěn)定性基因沉默是可行的。常規(guī)的基因敲除方法完全破壞基因的功能，只能得到該基因在最重要的生物學(xué)事件所起的作用。而RNAi則不能完全抑制基因功能，因?yàn)樗梢垣@得閥值效應(yīng)信息，根據(jù)RNAi作用的強(qiáng)弱會(huì)表現(xiàn)出一定表型。通過構(gòu)建相對(duì)簡易性和穩(wěn)定性的RNAi載體，使RNAi有希望成為功能基因組研究的重要手段。

RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的運(yùn)用一般依賴于3種小RNA類型。第一種是長dsRNA分子，是由體外轉(zhuǎn)錄的正義和反義鏈退火或轉(zhuǎn)錄成一條具有反向重復(fù)序列的單鏈，進(jìn)而形成具有發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的dsRNA，只有少數(shù)細(xì)胞系在轉(zhuǎn)染長dsRNA后能引發(fā)特異性反應(yīng)，對(duì)胚胎細(xì)胞的研究有很大的幫助[32]；第二種是小干涉RNA(siRNA)，小干擾RNA是一種堿基長度為21～24bp,由長ds RNA被類核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)的Dicer加工而成的雙鏈RNA，其主要生物學(xué)功能是參與RNA干擾(RNA interference，RNAi)，由于小于30個(gè)核苷酸的ds RNA不會(huì)引發(fā)非特異的副反應(yīng)，因此si RNA可作為介導(dǎo)RNAi效應(yīng)的有效載體運(yùn)用于哺乳動(dòng)物相關(guān)基因功能研究中[33]；第三種是體內(nèi)表達(dá)RNA，這種方法是利用傳染或者感染的方式將表達(dá)RNAi作用的DNA載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，在細(xì)胞中以游離或細(xì)胞基因整合的形式存在，隨后被RNA聚合酶III起始和終止RNA分子的轉(zhuǎn)錄，可作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得穩(wěn)定RNA干擾的有效方法[34]。

以下幾種方式可防止在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行RNAi時(shí)發(fā)生非序列特異性反應(yīng)。

(1)明確是未分化的具有早期胚胎發(fā)育階段特性的細(xì)胞，如卵母細(xì)胞，未分化的ES細(xì)胞，胚胎瘤細(xì)胞等；

(2)使用的監(jiān)視系統(tǒng)，要具有能夠躲避干擾素、足夠短、不會(huì)激活PKR的能力；

(3)使用能被Dicer酶加工成siRNA的類miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)。RNAi在細(xì)胞質(zhì)中也發(fā)揮著許多功能作用，因此，目標(biāo)mRNA的細(xì)胞定位可能影響觀察到的效力。

3.3 RNAi的相關(guān)功能及其在肉品質(zhì)中的應(yīng)用

隨著對(duì)肌肉生長抑制素的作用機(jī)理、調(diào)控機(jī)制的深入研究，RNAi的應(yīng)用前景廣泛，堿基突變的雙肌牛比其他品種牛具有更高的瘦肉率和優(yōu)質(zhì)肉塊百分率，顯示了基因在動(dòng)物生產(chǎn)上存在巨大的商業(yè)價(jià)值。研究者分別將基因干擾、基因敲除、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)應(yīng)用到畜牧生產(chǎn)上，為提高肉品質(zhì)工作開辟了新的途徑。

以通過RNAi手段使功能未知的結(jié)構(gòu)基因沉默，進(jìn)而對(duì)該結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行功能研究。目前，人們從哺乳動(dòng)物基因的功能研究中發(fā)現(xiàn)，利用RNAi技術(shù)得到的基因功能表現(xiàn)結(jié)果與基因敲除得到的結(jié)果一致，說明RNAi技術(shù)完全可以運(yùn)用到改善基因功能等方面的研究上。研究者對(duì)畜禽肉用性狀的研究，主要集中在瘦肉量和肉質(zhì)上。MSTN是在家畜、家禽等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中普遍存在的特異性抑制肌肉加倍表型的基因，通過敲除MSTN基因或使該基因發(fā)生突變，就能引起動(dòng)物雙肌現(xiàn)象提高肉品質(zhì)，因而MSTN是提高肉用動(dòng)物肌肉產(chǎn)量的理想靶基因。研究MSTN的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)闡明骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)理具有重要的理論意義，同時(shí)將為畜牧業(yè)肉用類動(dòng)物育種開辟一條新的途徑。

通過分子生物學(xué)手段利用RNAi技術(shù)控制肌肉抑制素基因或其他相關(guān)基因，可以提高畜禽的肉產(chǎn)量，從而獲得重大經(jīng)濟(jì)效益。與此同時(shí)，利用RNAi對(duì)肌肉抑制素基因功能的定向靶位缺失，能夠在不影響動(dòng)物繁殖能力和健康狀況的前提下，提高畜禽產(chǎn)肉性能，為動(dòng)物育種和動(dòng)物基因工程等方面提供全新的研究方向。目前，RNAi在遺傳育種以及食品安全方面上的應(yīng)用尚處于初級(jí)階段，在未來相關(guān)學(xué)術(shù)研究中將發(fā)揮巨大的作用。

4 小結(jié)

隨著當(dāng)今社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們對(duì)衣食住行等方面的需求也在日益提高。作為高蛋白、營養(yǎng)層度相對(duì)豐富的肉類食品，亦成為人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡囊徊糠?，其食品安全與肉質(zhì)口感也越來越受大家的重視。影響肉品質(zhì)的因素多種多樣，包括年齡、飼養(yǎng)方式、品種等。其中羊肉中纖維含量則直接影響肉制品的嫩度與口感，而影響肌肉纖維含量的直接原因是骨骼肌細(xì)胞的增值分化，對(duì)骨骼肌細(xì)胞的相關(guān)研究已成為近年來比較熱門的話題。許多研究集中在品質(zhì)特性和纖維特性之間的關(guān)系。在改善肉品質(zhì)方面，肌纖維的組織學(xué)特性是畜禽肉品質(zhì)的重要因素，而骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞可以改變肌纖維類型，因此通過調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化達(dá)到其目的。

本文綜述了骨骼肌細(xì)胞與肉品質(zhì)之間相關(guān)性、相關(guān)因子在肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化中的作用機(jī)制和RNA干擾在哺乳動(dòng)物研究中的運(yùn)用。目前，通過調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖發(fā)育改變肌纖維特性，進(jìn)而影響畜禽肉品質(zhì)的研究才剛剛起步，但它有望成為將來提高肉品質(zhì)的重要手段。