包成通，魏歆然，張依依，鐘 峰，匡泓俊，牛子青，劉小娟，王 璐，李俊熙，章 薇△

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

慢性蕁麻疹（CU）[1]是因皮膚黏膜的小血管短暫通透性增加，而出現(xiàn)局限性水腫的一種常見慢性疾病，以易反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，難以根治為主要特征，以皮膚風(fēng)團(tuán)、瘙癢、水腫等為主要臨床表現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制主要與自身免疫、感染、炎癥反應(yīng)等相關(guān)。CU屬中醫(yī)學(xué)“白疹”“癮疹”“風(fēng)疹”等范疇[2]，病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)，與血虛風(fēng)燥相關(guān)，氣血虧虛，衛(wèi)外失護(hù)，開泄失度，外邪（風(fēng)邪為主）乃入；氣血阻滯，精液不暢，布達(dá)難榮，化燥生風(fēng)，風(fēng)盛則瘙癢，正邪交爭于皮膚腠理，發(fā)為癮疹[3]。當(dāng)歸飲子出自《重訂嚴(yán)氏濟(jì)生方》[4]，由荊芥、黃芪、白蒺藜、何首烏、防風(fēng)合四物湯組成，具有養(yǎng)血和營、祛風(fēng)止癢之功，皮膚疥瘡，或癢或腫，或膿或發(fā)赤者適用，臨床上治療CU具有較好療效，主要與調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，但深層機(jī)制尚不明確。本研究基于生物信息學(xué)技術(shù)，采用GEO芯片聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，初步探討當(dāng)歸飲子治療CU的cross-talk及miRNA-mRNA深層機(jī)制，為后期實(shí)驗(yàn)及臨床驗(yàn)證提出理論現(xiàn)實(shí)依據(jù)，為CU的臨床治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 慢性蕁麻疹差異基因分析 以慢性蕁麻疹“Chronic Urticaria”為檢索詞，在NCBI基因表達(dá)GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索，獲取GSE57178芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集中包括6個(gè)病變皮膚樣本，7個(gè)非病變皮膚樣本，5個(gè)正常皮膚樣本。本研究采用R語言“l(fā)imma”包對比分析6個(gè)病變皮膚樣本（GSM1376737、GSM1376739、GSM1376741、GSM1376743、GSM1376745、GSM1376747） 與 5個(gè)正常皮膚樣本 （GSM1376750、GSM1376751、GSM 1376752、GSM1376753、GSM1376754），以│logFC│>1；P-value<0.05為篩選條件，篩選出慢性蕁麻疹的差異基因（Differential Expression Genes；DEGs），并繪制DEGs火山圖。

1.2 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點(diǎn)篩選 通過TCMSP[5（]http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）數(shù)據(jù)庫，以口服生物利用度（OB）≥30%；藥物類藥性（DL）≥0.18為篩選條件[6-7]，獲取當(dāng)歸飲子中藥有效成分。

通過PubChem[8（]https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫收集當(dāng)歸飲子中藥有效成分SDF結(jié)構(gòu)式。

通過Swiss Target Prediction[9（]http：//www.swis stargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫，將當(dāng)歸飲子中藥有效成分SDF結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入，獲取當(dāng)歸飲子潛在靶點(diǎn)。

通過R語言“VennDiagram”包繪制當(dāng)歸飲子潛在靶點(diǎn)與慢性蕁麻疹DEGs韋恩圖，以獲取當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的潛在靶點(diǎn)。

1.3 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?通過String[10（]https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的潛在靶點(diǎn)，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)信息，采用Cytoscape 3.7.2軟件對PPI信息進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。采用“Network Analysis”對PPI分析，設(shè)定 0＜Degree≤5 為“粉紅色”；5＜Degree≤10 為“藍(lán)色”；10＜Degree≤15“大紅色”；“Degree”值越大則節(jié)點(diǎn)越大，可信分?jǐn)?shù)越高則線條越粗；“Combined Score”值越大，邊越粗。采用“CytoHubba”對 PPI進(jìn)行“Closeness”、“Betweenness”、“MCC”拓?fù)浞治觯院Y選出當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的關(guān)鍵靶點(diǎn)（Hub-gene）。

1.4 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的cross-talk機(jī)制初探通過DAVID[11]（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的潛在靶點(diǎn)，獲取KEGG富集分析數(shù)據(jù)。采用R語言“ggplot2”包，以富集倍數(shù)為橫軸；通路為縱軸；-lgP為顏色；基因數(shù)為氣泡大小繪制KEGG富集分析氣泡圖。從當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的KEGG通路中，篩選出蕁麻疹最相關(guān)通路，采用R語言“circlize”包繪制“基因—KEGG”弦圖，以尋找出當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的通路靶點(diǎn)，同時(shí)采用 R語言“UpSetR”包繪制“基因—KEGG”UpSet圖，以篩選出當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的具體cross-talk通路靶點(diǎn)。

1.5 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的miRNA-mRNA機(jī)制初探利用TargetScan[12]（http：//www.targetscan.org/mamm_31/）數(shù)據(jù)庫反向預(yù)測當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點(diǎn)mRNA的miRNA，篩選并收集保守性miRNA，同時(shí)利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式。設(shè)定miRNA為方塊、灰色；mRNA為菱形、紅色。

2 結(jié)果

2.1 慢性蕁麻疹差異基因分析結(jié)果 采用R語言limma包對GEO芯片進(jìn)行差異分析，以│logFC│>1；P-value<0.05為篩選條件獲取DEGs，分析出257個(gè)差異基因，其中240個(gè)基因表達(dá)上調(diào)（如：HIF1A、MMP12、STAT3等）；有17個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（如：FABP7、KRT15、LGR5 等）。以“l(fā)ogFC”為橫軸，“-lgP”為縱軸，差異上調(diào)基因設(shè)為“紅色”，差異下調(diào)基因設(shè)為“藍(lán)色”，繪制 DEGs火山圖（圖 1）。

圖1 慢性蕁麻疹差異基因火山圖

2.2 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫，共獲取當(dāng)歸飲子中藥有效成分共202個(gè)，其中黃芪15個(gè)（如：Mairin、Jaranol、Bifendate等），白芍 13個(gè)（如：Paeoniflorgenone、Lactiflorin、beta-sitosterol等），川芎 7個(gè)（如：Wallichilide、Perlolyrine、Myricanone等），當(dāng)歸 2 個(gè)（如：beta-sitosterol、Stigmasterol），防風(fēng) 18 個(gè)（如：Anomalin、Divaricatacid、Ammidin等），何首烏 73個(gè)（如：beta-sitosterol、Tricin、Rhein等），蒺藜 12個(gè)（如：Terrestriamide、Isorhamnetin、Sitosterol等），荊芥 11個(gè)（如：Diosmetin、Sitosterol、Schizonepetoside B 等），生地黃 51個(gè)（如：Acteoside、Daucosterol、Glutinoside等）。

通過PubChem、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，對上述202個(gè)當(dāng)歸飲子中藥有效成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，去除重復(fù)值，保留唯一值后，共獲取964個(gè)當(dāng)歸飲子潛在靶點(diǎn)。采用R語言“VennDiagram”包繪制當(dāng)歸飲子潛在靶點(diǎn)與慢性蕁麻疹DEGs韋恩圖（圖2），獲取36個(gè)當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的潛在靶點(diǎn)（表1）。

圖2 當(dāng)歸飲子潛在靶點(diǎn)與慢性蕁麻疹DEGs韋恩圖

表1 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的潛在靶點(diǎn)

2.3 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治鼋Y(jié)果 通過String數(shù)據(jù)庫，采用Cytoscape 3.7.2軟件對PPI信息進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化及網(wǎng)絡(luò)分析（圖3），該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中，共有36個(gè)節(jié)點(diǎn)，91條邊，P<1.0e-16，平均節(jié)點(diǎn)度為5.06，平均聚類系數(shù)為0.584。根據(jù) Degree 值排序顯示：ITGB2＞TLR4＞STAT3＞VCAM1＞10，表示此4個(gè)靶點(diǎn)在當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹中作用最強(qiáng)。同時(shí)采用“CytoHubba”對PPI進(jìn)行“Closeness”、“Betweenness”、“MCC”拓?fù)浞治觯▓D 4），以篩選出 Hub-gene（表 2）。

圖3 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹Hub-gene

圖4 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點(diǎn)拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)圖

2.4 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的cross-talk機(jī)制 通過DAVID數(shù)據(jù)庫，獲取KEGG富集分析數(shù)據(jù)，采用R 語言“ggplot2”“circlize”“UpSetR”包，分別繪制“基因—KEGG”氣泡圖、弦圖、UpSet圖。當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點(diǎn)共富集17條KEGG通路，如氣泡圖所示（圖5A）：NF-kappa B通路、HIF-1通路、TNF通路等。通路富集的基因靶點(diǎn)，如弦圖所示 （圖 5B）：NF-kappa B 通路由 LYN、VCAM1、TLR4、ICAM1基因靶點(diǎn)富集；HIF-1通路由STAT3、HIF1A、TLR4基因靶點(diǎn)富集；TNF通路由VCAM1、SELE、ICAM1基因靶點(diǎn)富集等。cross-talk是通路共同基因靶點(diǎn)相互“串話”，激活2條以上通路，介導(dǎo)一種或多種表型的機(jī)制模式，當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹潛在靶點(diǎn)中cross-talk機(jī)制如UpSet圖所示（圖5C）：1個(gè)靶點(diǎn)（SELE）在TNF通路與細(xì)胞粘附分子（CAMs）2條通路中“串話”；1個(gè)靶點(diǎn)（ITGB2）在吞噬體與CAMs 2條通路中“串話”；2個(gè)靶點(diǎn)（CTSL、CTSS）在抗原處理表達(dá)、吞噬體與溶酶體3條通路中“串話”；2個(gè)靶點(diǎn)（VCAM1、ICAM1）在 NF-kappa B、TNF與CAMs 3條通路中“串話”；1個(gè)靶點(diǎn)（TLR4）在 HIF-1、NF-kappa B、吞噬體 3條通路中“串話”。

圖5 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹“基因—KEGG”氣泡圖（A）、弦圖（B）、UpSet圖（C）

2.5 當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的miRNA-mRNA機(jī)制 TargetScan數(shù)據(jù)庫反向預(yù)測當(dāng)歸飲子治療慢性蕁麻疹的miRNA，其中36個(gè)潛在靶點(diǎn)中，共有24個(gè)潛在靶點(diǎn) mRNA（如：TLR4、HIF1A、STAT3等）存在保守 miRNA（如：miR-140-5p；miR-542-3p；miR-489-3p等）調(diào)控，構(gòu)成了477組miRNA-mRNA模式（如 ：miR-140-5p-TLR4；miR-199a-5p-HIF1A；miR-370-3p-STAT3等），相互作用結(jié)果如圖6。

圖6 相互作用結(jié)果

3 討論

cross-talk即“串話”[13]，原指通信線路上信號(hào)雜散耦合到其他通信線路造成干擾的現(xiàn)象，在細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)研究中，認(rèn)為細(xì)胞間信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，單一信號(hào)通路在一定條件下會(huì)受到其它信號(hào)通路的影響，從而產(chǎn)生了細(xì)胞生物學(xué)界的“信號(hào)串話”。 miRNA[14]是微小的非編碼RNA，主要通過結(jié)合靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（UTR），導(dǎo)致靶mRNA進(jìn)行切割或轉(zhuǎn)錄抑制。在CU的治療中cross-talk與miRNA-mRNA機(jī)制是當(dāng)前的熱點(diǎn)問題。

當(dāng)歸飲子由荊芥、黃芪、白蒺藜、何首烏、防風(fēng)、當(dāng)歸、川芎、白芍、生地黃組成，方中四物湯養(yǎng)血活血，補(bǔ)通同用；何首烏養(yǎng)血滋陰，祛風(fēng)止癢；黃芪益氣實(shí)表，托毒行滯；白蒺藜、防風(fēng)、荊芥散風(fēng)邪以止癢，全方共奏養(yǎng)血、滋陰、潤燥、祛風(fēng)之功，善治CU之血虛風(fēng)燥證。當(dāng)歸飲子治療CU血虛風(fēng)燥證具有較好的療效，且在實(shí)驗(yàn)中得到廣泛驗(yàn)證，葉靜靜[15]對168例CU患者進(jìn)行RCT，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸飲子能顯著降低患者血清中MDA含量，抗氧化應(yīng)激以提高免疫，從而降低CU復(fù)發(fā)率，改善患者瘙癢、水腫等癥狀。徐風(fēng)等[16]研究證實(shí)當(dāng)歸飲子能下調(diào)LC3II、p62表達(dá)，促進(jìn)自噬小體形成，改善CU水腫及毛細(xì)血管擴(kuò)張，但其深層機(jī)制尚未明確，需待進(jìn)一步研究。

本研究旨在利用生物信息學(xué)算法研究當(dāng)歸飲子治療CU的cross-talk及miRNA-mRNA機(jī)制。GEO芯片差異分析出257個(gè)差異基因，240個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，17 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（如：FABP7、KRT15、LGR5等）。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析出當(dāng)歸飲子有效成分及潛在靶點(diǎn)共964個(gè)，取潛在靶點(diǎn)與差異基因交集后得到36個(gè)當(dāng)歸飲子治療CU的潛在靶點(diǎn)；對篩選分析出的當(dāng)歸飲子治療 CU的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行 PPI、KEGG、cross-talk及miRNA預(yù)測分析，以初步明確當(dāng)歸飲子治療CU的分子機(jī)制。

當(dāng)歸飲子治療CU的PPI網(wǎng)絡(luò)分析中，有36個(gè)節(jié)點(diǎn)（基因），91條邊，拓?fù)浞治龀?TLR4、STAT3、ITGB2等18個(gè)關(guān)鍵基因，能初步認(rèn)為此18個(gè)基因可能在當(dāng)歸飲子治療CU中作用最強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)CU患者外周血中TLR4顯著升高，TLR4能誘導(dǎo)IL-6和MIP-1α分泌，介導(dǎo)CU患者免疫炎癥反應(yīng)[17]，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸飲子中有效成分當(dāng)歸多糖[18]在多種疾病中能抑制TLR4表達(dá)[19-20]，抑制炎癥反應(yīng)。Luo等[21]研究發(fā)現(xiàn)CU患者皮膚組織中JAK2/STAT3信號(hào)通路被激活，炎癥細(xì)胞增殖，此過程能被OSMR能被抑制，同時(shí)王麗新[22]提出STAT3是檢測CU臨床療效的潛在客觀指標(biāo)之一。因此可認(rèn)為36個(gè)當(dāng)歸飲子治療CU的靶點(diǎn)中的18個(gè)可作為潛在的臨床療效標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

cross-talk是通路共同基因靶點(diǎn)相互“串話”，激活2條以上通路，介導(dǎo)一種或多種表型的機(jī)制模式，本研究以KEGG富集分析為切入點(diǎn)，結(jié)合關(guān)聯(lián)性弦圖及UpSet圖，將篩選出的“通路串話”靶點(diǎn)進(jìn)行可視化（如：TLR4可能在HIF-1、NF-kappa B、吞噬體3條通路中“串話”等）。Pei等[23]研究發(fā)現(xiàn)IL-38能通過HIF-1與NF-kappa B信號(hào)通路，降低HIF-1α、NFΚB p65與TLR4表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，在大鼠模型中初步驗(yàn)證了TLR4可能參與HIF-1與NF-kappa B信號(hào)通路之間的串話，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。Hu等[24]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞表面的雙鏈蛋白聚糖（BGN）與其受體TLR2、TLR4結(jié)合，激活HIF-1與NF-kappa B信號(hào)通路，增強(qiáng)HIF-1α、NF-κB啟動(dòng)子之間的相互作用，從而刺激下游VEGF表達(dá)。本研究構(gòu)建的cross-talk“通路串話”機(jī)制模式，雖已有部分在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證，但仍有大量的cross-talk模式尚未研究，因此不僅可作為當(dāng)歸飲子治療CU的分子機(jī)制，而且也為其他疾病的治療提供了新的思路。

miRNA是一類廣泛存在于動(dòng)植物中，對轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控起關(guān)鍵作用的內(nèi)源性小非編碼RNA。成熟miRNA先與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的復(fù)合物結(jié)合，再特異性與下游靶mRNA的3’UTR形成不完全互補(bǔ)配對，阻斷轉(zhuǎn)錄后翻譯，從而調(diào)控基因表達(dá)，此過程稱為miRNA-mRNA互作模式。本研究初步篩選出TLR4、HIF1A、STAT3在內(nèi)的24個(gè)潛在靶點(diǎn)的477組miRNA-mRNA模式（如：miR-140-5p-TLR4；miR-199a-5p-HIF1A；miR-370-3p-STAT3等）。Ching-Kow等[25]通過miRNA微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)CU患者中有16種差異miRNA（DEMs），其中5個(gè)miRNA（miR-2355-3p、261-3p、4264、2355-5p、29c-5p）與7個(gè)上調(diào)mRNA（FBXL20，OPHN1，YPEL2，STARD9，SELE，KLHL24，ING4） 相互作用明顯，對CU疾病的診斷與治療提出了指導(dǎo)性的建議，構(gòu)建的miRNA-mRNA模式中與本研究篩選的miR-6835-3p-SELE、miR-6893-3p-STAT3；miR-140-5p-TLR4等相互吻合，因此本研究構(gòu)建的當(dāng)歸飲子治療CU的miRNA-mRNA模式能成為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的潛在分子機(jī)制模式。

綜上所述，本研究采用GEO芯片聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選出當(dāng)歸飲子治療CU的關(guān)鍵靶點(diǎn)，構(gòu)建了蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步從通路、cross-ralk、miRNA-mRNA機(jī)制角度得出當(dāng)歸飲子治療CU可能通過 TLR4參與的HIF-1、NF-kappa B、吞噬體3條通路中“串話”機(jī)制發(fā)揮作用，同時(shí)miR-140-5p-TLR4的相互作用關(guān)系可能在其中發(fā)揮重要作用，同時(shí)得出當(dāng)歸飲子治療CU的多靶點(diǎn)、多cross-ralk、多miRNA-mRNA機(jī)制將成為未來機(jī)制研究的新方向。本研究從基因、分子角度預(yù)測和分析了當(dāng)歸飲子治療CU的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供了依據(jù)。