袁銘杰 劉天一 陳 亮 王萬晨 劉 馳 畢 波

復旦大學附屬華東醫(yī)院整形美容外科，上海，200040

惡性黑素瘤(malignant melanoma, MM)是一種來源于黑素細胞的腫瘤，其惡性程度高，預后差。目前MM的發(fā)病率約以每年3%～5%的速度增長，近年來，其死亡率也存在逐漸升高的趨勢[1]。目前國內(nèi)針對晚期惡性黑素瘤患者，臨床常用的治療手段仍以姑息手術、化療和放療為主，但治療效果并不理想[2]。因此，有待發(fā)現(xiàn)新的黑素瘤治療方法。大黃素(emodin)是一種提取自大黃、虎杖、何首烏等多種中藥材根莖中的天然蒽醌類衍生物，許多研究表明，大黃素具有抗炎、抑菌及免疫調節(jié)等多種生物學作用[3-5]。且隨著對大黃素抗腫瘤活性研究的進一步深入，研究人員發(fā)現(xiàn)大黃素可通過抑制腫瘤細胞增殖、遷移，并促進其凋亡等方式對肺癌，乳腺癌等腫瘤起抑制作用[6,7]。本研究主要觀察大黃素對小鼠黑素瘤細胞B16F10增殖，遷移及凋亡情況的影響，為大黃素治療黑素瘤的臨床應用上提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞株和主要試劑 小鼠黑素瘤B16F10細胞，購自中國科學院細胞庫；大黃素、二甲亞砜(DMSO)購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，CCK-8試劑盒，0.25% EDTA-胰酶購自美國Gibco公司；TUNEL試劑盒，PI染液，DAPI染色試劑盒購自南京凱基生物有限公司；青霉素、鏈霉素溶液購自Amresco公司；6孔細胞培養(yǎng)皿和96 孔細胞培養(yǎng)皿購自美國Costar公司。caspase-3抗體購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 大黃素用DMSO溶解成0.2 mmol/L母液，放置-20℃冰箱保存，使用時用DEME培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，DMSO在大黃素溶液中的質量分數(shù)小于0.1%。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 取生長狀態(tài)良好B16F10細胞，用加入10%的胎牛血清，青霉素(終濃度100 U/L)及鏈霉素(終濃度100 mg/L)的DMEM培養(yǎng)液(pH=7.4)，在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.3 細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期的細胞，PBS清洗兩遍，加入0.25%的胰酶室溫消化細胞并轉移至離心管中，重懸細胞后，采用血細胞計數(shù)板于顯微鏡下進行細胞計數(shù)，取1×104/孔密度接種于96孔板中，對照組加入0.1% DMSO溶液，實驗組加入10、20、40、60、80 μmol/L大黃素處理24 h及48 h，加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，酶標儀450 nm下檢測吸光值，同時設置空白調零組(不加細胞只加入等量的 PBS)，實驗重復3次。并進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 倒置顯微鏡下觀察 取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化離心后，將細胞按1×105/孔密度接種于6孔板，待細胞貼壁狀態(tài)良好，對照組加入0.1% DMSO溶液，實驗組加入60 μmol/L大黃素培養(yǎng)基處理細胞24 h，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 細胞劃痕實驗 取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，待細胞生長至100%時，在6孔板底部用marker筆畫3條平行的直線，用100 μL槍頭在6孔板中垂直均勻慢速的劃線，PBS洗凈劃線掉落的細胞，加入不同濃度大黃素無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，并于24 h倒置熒光顯微鏡下觀察劃痕愈合情況，拍照儲存，使用imageJ計算劃痕愈合率。

1.2.6 Transwell遷移實驗 取對數(shù)生長期細胞，并在無血清培養(yǎng)基中加入20、40、60 μmol/L大黃素溶液處理細胞，取150 μL密度為2×105/mL的處理細胞添加到上室,對照組加入0.1%DMSO溶液。下層24孔板中加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基800 μL，將24孔板放置在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后吸干上室液體，用棉簽小心擦去上室底部膜表面細胞，4%多聚甲醛固定Transwell小孔的底面，并用結晶紫染色20 min，顯微鏡下拍照并計數(shù)，統(tǒng)計分析各組之間的差異。

1.2.7 檢測細胞周期 用胰酶消化并收集經(jīng)20、40、60 μmol/L大黃素溶液處理24 h后的細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，加入70%乙醇在4℃下固定4 h，再次使用PBS溶液洗滌2次后加入500 μL PBS(50 μg/mL溴化乙錠，100 μg/mL RNase A, 0.2%Triton X-100)于4℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，最后進行流式細胞儀的檢測。

1.2.8 TUNEL法檢測B16F10細胞凋亡 將細胞爬片消毒，去離子水多次沖洗并高壓滅菌，烘干后備用。將B16F10細胞按2×105/孔密度種入24孔板內(nèi)，培養(yǎng)過夜；待細胞貼壁后，加入大黃素(60 μmol/L)，繼續(xù)孵育24 h。將自然晾干的細胞爬片，采用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次,每次5 min。按凱基試劑盒說明書配制TUNEL反應液，整個過程冰上操作。滴加反應液于每張細胞爬片，使反應液完全覆蓋細胞區(qū)域。37℃避光反應1 h，PBS洗3次,每次5 min。將DAPI液稀釋為1 mg/L后滴加于細胞爬片，37℃避光反應15 min，PBS洗3次,每次5 min。滴加防淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，避開周邊區(qū)域，隨機選取3個視野并計數(shù)，激光共聚焦顯微鏡下拍照儲存。

1.2.9 Western blot法檢測凋亡相關蛋白 當以20、40和60 μmol/L大黃素處理細胞24 h后，收集蛋白質并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。將分離的蛋白質在90 V和200 mA的條件下轉移到PVDF膜上，用封閉液封閉1 h。將PVDF膜在抗體稀釋溶液(兔抗小鼠caspase-3和β-actin；1∶3000)中于4℃孵育過夜。然后將印跡與二抗(1∶3000)4℃避光孵育1 h，再用PBST洗膜后用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有實驗均重復3次后，計量資料采用(均數(shù)±標準差)表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大黃素對B16F10細胞增殖的影響 用不同濃度大黃素(10、20、40、60、80 μmol/L)作用B16F10細胞24 h后，細胞存活率分別為(90.1±1.4)%、(84.1±2.3)%、(76.6±3.7)%、(71.6±1.2)%、(56.8±2.8)%，作用48 h后，細胞存活率分別為(86.1±2.7)%、(75.5±2.1)%、(63.0±4.4)%、(54.3±5.3)%、(44.8±2.7)%，表明大黃素對B16F10細胞增殖的抑制作用具有時間依賴性。與對照組相比，不同濃度大黃素組均存在顯著性差異(P<0.05)(圖1)，且隨著大黃素濃度的提升，細胞活性也隨之降低，表明大黃素呈濃度依賴性的抑制B16F10細胞增殖。24 h測得IC50為131.9 μmol/L，48 h測得IC50為68.1 μmol/L。

2.2 細胞形態(tài)及數(shù)目改變 使用60 μmol/L大黃素處理B16F10細胞24 h后，對照組細胞生長狀況良好，顯微鏡下觀察呈貼壁形態(tài)不一的梭型，而大黃素組中細胞數(shù)目逐漸減少且細胞形態(tài)拉長呈現(xiàn)網(wǎng)狀樹突樣結構。部分細胞在高濃度大黃素處理后，細胞體積縮小，固縮呈圓形(圖 2)。

2.3 大黃素對B16F10細胞遷移的影響 使用梯度濃度的大黃素(20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)分別處理B16F10細胞24 h后，實驗組劃痕愈合面積較對照組明顯減小(圖3a)，且隨著濃度的增加，大黃素對B16F10細胞遷移的抑制作用更加明顯，細胞橫向遷移率分別為(77.4±2.1)%、(57.2±3.7)%、(40.9±3.3)%、(7.9±1.7)%(圖4a)。在Transwell遷移實驗中，用相同梯度濃度的大黃素溶液處理B16F10細胞24 h，顯微鏡下可見遷移至Transwell膜底面的細胞數(shù)較對照組均明顯減少，并呈濃度依賴性改變(圖3b)，實驗組遷移至膜底面的細胞數(shù)分別為(400.2±10.3)、(276.3±6.6)、(163.3±8.7)、(87.7±6.1)個，較對照組具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(圖4b)。

圖1 不同濃度大黃素對B16F10細胞增殖的影響 注：*與對照組比較,P<0.05 圖2 大黃素處理24 h后細胞形態(tài)及數(shù)目的變化(倒置顯微鏡，×100)

2.4 大黃素對細胞周期的影響 在對照組中大多數(shù)細胞處于G0/G1期和S期，少數(shù)細胞處于G2/M期，隨著藥物濃度的上升，處于G0/G1期的細胞數(shù)目開始逐漸下降。與對照組相比，大黃素組S期細胞數(shù)目減少，而G2/M期細胞數(shù)目出現(xiàn)升高(圖5)。

2.5 大黃素對B16F10細胞凋亡的影響 使用大黃素溶液處理黑素瘤細胞24 h后，細胞經(jīng)染色后置于熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)細胞核濃縮和核碎片的細胞被判定為凋亡細胞。對照組DAPI染色后細胞核大多規(guī)則，呈圓形淺藍色，TUNEL著色細胞少；實驗組細胞凋亡個數(shù)較對照組明顯增加，凋亡細胞細胞核濃縮，或碎裂呈不規(guī)則形態(tài)，并出現(xiàn)點狀細胞核碎片(圖6)。

4a:20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L大黃素處理24 h后，各組劃痕實驗細胞遷移率；4b:20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L大黃素處理24 h后，Transwell實驗中各組遷移至膜底面的細胞個數(shù)。*與對照組比較,P<0.05

5a：流式細胞術檢測不同濃度大黃素作用后的細胞周期分布；5b：不同濃度大黃素作用后細胞周期分布的定量分析，*與對照組比較,P<0.05

注：對照組B16F10細胞凋亡數(shù)目較少；大黃素組B16F10細胞凋亡數(shù)目增多

2.6 大黃素對細胞caspase-3蛋白水平表達的影響 caspase-3作為凋亡的執(zhí)行分子對細胞凋亡有重要影響。Western blot檢測結果如圖7所示，這些結果表明不同濃度大黃素(40 μmol/L、60 μmol/L)處理的細胞中caspase-3的表達水平增加。 這些結果證實大黃素可能通過線粒體途徑促進B16F10細胞凋亡。

注：不同濃度大黃素(40 μmol/L、60 μmol/L)處理的細胞中caspase-3的表達水平增加

3 討論

黑素瘤增殖及侵襲能力強是導致其早期出現(xiàn)淋巴轉移和遠處轉移的主要因素，且黑素瘤化療效果差使得晚期黑素瘤患者5年生存率很低[8]。雖然這兩年來個體化的靶向治療和免疫治療在晚期黑素瘤中取得了一定進展[9,10]，但缺乏中國患者應用免疫及靶向藥物的相關數(shù)據(jù)。近來多項研究表明，大黃素可通過抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡來抑制腫瘤生長，且大黃素毒性小，不良反應少，能和多種抗腫瘤藥物協(xié)同作用，并能降低其腫瘤耐藥性[11-15]。大黃素在16 μg/mL濃度下才對小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)產(chǎn)生明顯增殖抑制作用[16]。

誘導細胞凋亡是藥物實現(xiàn)抗腫瘤作用的一項重要機制。有研究顯示,大黃素可經(jīng)線粒體途徑上調caspase-9，3分子表達，從而誘導HeLa細胞凋亡。同時可通過細胞外途徑上調Fas及FasL等分子表達來誘導細胞凋亡[17]。線粒體凋亡途徑是實現(xiàn)大黃素誘導細胞凋亡的主要抗腫瘤方式[18]，大黃素作用于細胞后可導致細胞色素C釋放，引起caspase-9變構活化,活化的caspase-9分子進而激活下游caspase-3等凋亡效應分子，最終引起細胞凋亡。大黃素在誘導細胞凋亡的同時可伴有細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)的失活,并能促進活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生[19]。Fang等[20]研究發(fā)現(xiàn)大黃素可通過下調CD155的表達從而抑制腫瘤增殖并將細胞阻滯于G2/M期。近期一項大黃素作用于黑素瘤的研究顯示[16]，大黃素可以充當線粒體解偶聯(lián)劑，干擾線粒體氧化磷酸化，促進活性氧產(chǎn)生，降低了腫瘤細胞ATP的合成，進而影響腫瘤細胞糖酵解及能量代謝，從而抑制腫瘤增殖。大黃素還可通過降低MMP2和MMP9等分子的表達，減少對細胞外基質的降解，抑制腫瘤微血管的形成進而抑制腫瘤的侵襲和轉移[21]。其他研究表明，各類惡性黑素瘤均具有黑色素合成能力，大黃素作為一種天然蒽醌類衍生物，可抑制酪氨酸酶活性，減少黑色素的形成[22]，大黃素抗腫瘤能力也可能與其抗黑色素形成相關[23]。

本研究中，我們首先通過CCK8實驗觀察大黃素對B16F10細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)大黃素呈濃度及時間依賴性抑制B16F10細胞的增殖，并將細胞阻滯于G2/M期。細胞劃痕實驗及Transwell遷移實驗顯示大黃素能有效降低B16F10細胞的遷移能力，且具有劑量依賴性。大黃素干預后引起細胞的熒光染色及細胞形態(tài)的改變，且上調了凋亡相關蛋白caspase-3的表達，表明大黃素的干預可導致黑素瘤細胞出現(xiàn)凋亡變化。結合文獻，可以推斷B16F10細胞的變化可能與大黃素作用后腫瘤細胞線粒體改變有關，是大黃素抑制黑素瘤細胞增殖，促進凋亡的主要機制之一。

本實驗在不同作用條件下觀察了大黃素對小鼠黑素瘤細胞B16F10的影響，實驗結果提示，大黃素可有效抑制B16F10細胞增殖、遷移能力，并促進細胞凋亡。但大黃素在如何調控及促進細胞凋亡方面還有待于更深一層的研究。