余 凡 蘇 欣 安蘭芳 周絲雨 高利增 朱曉芳

1大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧大連，116044；2揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州，225001；3中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙，410011；4中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所中國(guó)科學(xué)院納米酶工程實(shí)驗(yàn)室，北京，100101；5揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院皮膚科，江蘇揚(yáng)州，225001

納米酶是一類具有類酶活性的納米材料[1]，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在抗腫瘤和抗菌方面取得了一定的成果[2-7]。納米酶可以通過不同的操作(包括磁場(chǎng)、光、超聲和熱)來進(jìn)行遠(yuǎn)程控制[8]，其酶活性也可以通過外部物理或生物刺激(例如光或pH)來調(diào)節(jié)[9]。氮摻雜碳納米酶(nitrogen-doped carbon nanozyme, N-Carbon nanozyme)是一種新興的納米酶，具有四種酶樣活性：氧化酶，過氧化物酶，過氧化氫酶和超氧化物歧化酶，能夠催化活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生和清除[10]。

最近，利用光吸收劑吸收光能并釋放熱能的光熱療法(photothermal therapy, PTT)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。PTT具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如微創(chuàng)性、不良反應(yīng)少以及時(shí)空選擇性的優(yōu)點(diǎn)[11]。基于各種碳材料(如碳納米管和石墨烯材料)的PTT已被研究用于癌癥治療、藥物輸送和抗菌治療[12]。

N-Carbon nanozyme不僅具有酶催化活性，還具有光熱效應(yīng)，而近紅外光(near infrared, NIR)具有顯著的熱效應(yīng)。因此，在本論文中我們以白念珠菌和紅色毛癬菌為研究對(duì)象，進(jìn)行了N-Carbon nanozyme聯(lián)合808 nmNIR體外抗真菌實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 紅色毛癬菌(ATCC MYA 4438)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所；白念珠菌(ATCC 10231)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

1.1.2 主要試劑 戊二醛，福爾馬林水溶液(37wt%)，苯酚和三聚氰胺購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，三嵌段共聚物Pluronic F127(MW=12600，PEO106PPO70-PEO106)購(gòu)自Acros Organics(美國(guó))，PI熒光染料購(gòu)自Invitrogen(美國(guó))，SYTO 9綠色熒光核酸染料購(gòu)自Life Technologies Corporation。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB)按照標(biāo)準(zhǔn)制備。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化 所有實(shí)驗(yàn)用菌株接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，活化2次(白念珠菌在37℃培養(yǎng)2 d，紅色毛癬菌在28℃培養(yǎng)7～14 d)。

1.2.2 菌懸液的制備 紅色毛癬菌：取活化好的紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，加入無菌生理鹽水1 mL，用刮勺輕輕搔刮真菌菌落，將所得混懸液靜置15 min沉淀菌絲，取上清液，采用分光光度計(jì)在600 nm處，調(diào)整菌懸液至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷岫?，相?dāng)于(1～5)×106CFU/mL，備用。

白念珠菌：挑取白念珠菌菌落，接種于5 mL SDB培養(yǎng)液中，于37℃震蕩培養(yǎng)，活化2次，培養(yǎng)24 h使真菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。采用分光光度計(jì)在600 nm處，調(diào)整菌懸液至0.7個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷岫?，相?dāng)于(1～5)×107CFU/mL，備用。

1.2.3 N-Carbon nanozyme的制備和表征 我們分別以含有三聚氰胺和福爾馬林/苯酚的F127軟模板為氮和碳源，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]，采用熱解法制備N-Carbon nanozyme。N-Carbon nanozyme的表征采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(S-4800II，Hitachi，日本)和透射電鏡(Tecnai 12，Philips，荷蘭)進(jìn)行觀察。

1.2.4 N-Carbon nanozyme濃度及NIR照射能量的篩選 取白念珠菌菌懸液，分別固定N-Carbon nanozyme濃度、NIR照射功率及時(shí)長(zhǎng)中的2個(gè)變量進(jìn)行試驗(yàn)，總計(jì)反應(yīng)30 min，稀釋后取100 μL均勻涂布于SDA培養(yǎng)基平板上，每組重復(fù)2次，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h后數(shù)菌。最后選擇N-Carbon nanozyme的濃度為250 μg/mL，NIR的功率為2.5 W/cm2，照光時(shí)長(zhǎng)為8 min。

1.2.5 體外抗真菌試驗(yàn)分組 取培養(yǎng)好的真菌隨機(jī)分為四組：(1)空白對(duì)照組：僅真菌，不進(jìn)行任何處理；(2)光照組：用功率為2.5 W/cm2的NIR照射真菌8 min；(3)材料組：真菌中加入250 μg/mL的N-Carbon nanozyme處理30 min；(4)實(shí)驗(yàn)組：真菌中加入250 μg/mL的N-Carbon nanozyme，同時(shí)進(jìn)行NIR照射8 min。

1.2.6 體外抗真菌效果判斷 本研究中抗真菌活性觀察采用共聚焦熒光染色，因有活性和無活性真菌的細(xì)胞膜通透性存在差異，使用SYTO 9/PI染色可以判斷菌體活性的變化。SYTO 9核酸染色劑是一種綠色熒光染料，可以對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色以定位真菌[16]。PI是一種紅色熒光染料，僅能穿透受損細(xì)胞膜對(duì)核酸進(jìn)行染色，因此可標(biāo)記死細(xì)胞[17]。對(duì)白念珠菌抗菌活性研究還采用了掃描電鏡觀察形態(tài)以及平板計(jì)數(shù)法，根據(jù)菌落形成單位(CFU)的數(shù)量來判定(該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍)。

共聚焦熒光測(cè)定：24孔板中，放入無菌玻片，白念珠菌、紅色毛癬菌各分為4組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，白念珠菌在SDB中培養(yǎng)36 h，紅色毛癬菌在SDB中培養(yǎng)7 d，經(jīng)各組實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后，用PI染色20 min，然后SYTO 9復(fù)染10 min后，用共聚焦熒光顯微鏡(TCS SP8 STED，Leica，德國(guó))來觀察。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

掃描電鏡觀察：白念珠菌培養(yǎng)同上，經(jīng)各組實(shí)驗(yàn)作用結(jié)束后，用2.5%戊二醛固定。然后，將細(xì)胞通過一系列乙醇/水混合物進(jìn)行梯度脫水，并通過CO2超臨界干燥。最后，使用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(GeminiSEM 300，Zeiss，英國(guó))觀察所獲得的干燥真菌。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究部分?jǐn)?shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 19進(jìn)行單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t方法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 N-Carbon nanozyme的表征 通過透射電鏡、掃描電鏡觀察，碳納米球表現(xiàn)出基本統(tǒng)一的大小，直徑約為(150±10)nm，并且表面表現(xiàn)出多孔結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)(圖1)。

1a：掃描電鏡圖像；1b：透射電鏡圖像

2.2 N-Carbon nanozyme的光熱效應(yīng)觀察 N-Carbon nanozyme經(jīng)NIR照射后，可以將近紅外光轉(zhuǎn)換為熱能。隨著N-Carbon nanozyme濃度的增加溫度升高更明顯，可見光熱轉(zhuǎn)換效率具有濃度依賴性(圖2a)。N-Carbon nanozyme濃度固定的情況下，NIR的功率越高溫度升高越明顯，可見光熱轉(zhuǎn)換效率也與功率的強(qiáng)度有關(guān)(圖2b)。

2a：在NIR(2.5 W/cm2)照射下，不同濃度的N-Carbon nanozyme的溫度升高情況；2b：250 μg/mL的N-Carbon nanozyme在NIR不同能量密度照射下的溫度升高情況

2.3 N-Carbon nanozyme聯(lián)合NIR對(duì)白念珠菌的抑菌作用 根據(jù)平板計(jì)數(shù)法來直觀地觀察N-Carbon nanozyme及NIR對(duì)白念珠菌的抑菌效果。結(jié)果如圖3a、4a，與空白對(duì)照組相比，光照組和材料組中白念珠菌的存活率仍高，未見明顯死亡。而實(shí)驗(yàn)組中白念珠菌的活力明顯降低，抑菌率為99.9%以上，降低了至少3-log10(P<0.0001)。而且，N-Carbon nanozyme聯(lián)合NIR的抗菌能力，與N-Carbon nanozyme的濃度(圖4c)和NIR照射的能量密度有關(guān)(圖4d)。同時(shí)，為了進(jìn)一步了解加熱對(duì)白念珠菌的影響，我們進(jìn)行了對(duì)比測(cè)試。因N-Carbon nanozyme經(jīng)NIR照射8 min誘導(dǎo)的溫度約為50℃，所以設(shè)置50℃水浴對(duì)照組。結(jié)果如圖3b、4b，與空白對(duì)照組相比，溫度對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中白念珠菌的活力均明顯降低(P<0.001)。雖然水浴的外部加熱確實(shí)會(huì)誘導(dǎo)白念珠菌的死亡，但抗菌效果不如實(shí)驗(yàn)組(P<0.0001)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證N-Carbon nanozyme的光熱抗菌作用，將經(jīng)各組實(shí)驗(yàn)處理后的白念珠菌樣品使用SYTO 9/PI進(jìn)行染色，通過共聚焦顯微鏡收集熒光圖像。如圖5，空白對(duì)照組幾乎沒有紅色熒光，而光照組和材料組可見少量紅色熒光，說明很大比例的白念珠菌仍然存活。相反，在實(shí)驗(yàn)組的圖像中能觀察到明顯的紅色熒光，這意味著幾乎所有的真菌都被光熱處理殺滅。因此，所有結(jié)果表明，借助于808 nm的近紅外光照射，N-Carbon nanozyme具有高效的抗真菌能力。

同時(shí)，我們運(yùn)用掃描電鏡觀察經(jīng)各組實(shí)驗(yàn)處理后的白念珠菌的形態(tài)變化，進(jìn)一步探討N-Carbon nanozyme聯(lián)合NIR對(duì)白念珠菌的影響。如圖6，對(duì)照組中的白念珠菌表現(xiàn)出典型的球狀形狀，細(xì)胞壁完整且光滑；光照組和材料組中白念珠菌沒有顯示出可觀察到的壁損傷或細(xì)胞死亡。但是，實(shí)驗(yàn)組中可觀察到，盡管某些真菌細(xì)胞仍保持其完整性，但細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變，變得粗糙及皺縮。

2.4 N-Carbon nanozyme聯(lián)合NIR對(duì)紅色毛癬菌的抑菌效果 我們運(yùn)用SYTO 9/PI死活染色法對(duì)處理后的的紅色毛癬菌樣品進(jìn)行染色。結(jié)果如圖7，空白對(duì)照組、光照組及材料組均存在部分紅色熒光，但仍有很大比例的紅色毛癬菌存活。相反，在實(shí)驗(yàn)組中，觀察到較大比例的紅色熒光，這意味著大部分的紅色毛癬菌被光熱處理殺滅。

3a：光照組、材料組與空白對(duì)照組間菌落數(shù)未見明顯差異，而實(shí)驗(yàn)組可見菌落明顯減少;3b：與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組、溫度對(duì)照組(50℃水浴8 min)的菌落數(shù)均見明顯減少，而實(shí)驗(yàn)組與溫度對(duì)照組相比，減少更明顯

4a：白念珠菌在經(jīng)NIR或(和)N-Carbon nanozyme處理后的菌體活力；4b：白念珠菌在50℃水浴(8 min)與經(jīng)N-Carbon nanozyme+NIR處理后的菌體活力；4c：在NIR(2.5 W/cm2，8 min)照射下，白念珠菌經(jīng)不同濃度的N-Carbon nanozyme處理后的菌體活力；4d：白念珠菌經(jīng)NIR(8 min)不同能量密度及N-Carbon nanozyme(250 μg/mL)處理后的菌體活力 注：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001，“****”表示P<0.0001

綠色定位所有白念珠菌，紅色代表死亡白念珠菌；其中空白對(duì)照組幾乎沒有紅色熒光，而光照組和材料組可見少量紅色熒光，試驗(yàn)組見大量紅色熒光

3 討論

皮膚淺部真菌感染主要侵犯皮膚、黏膜、毛發(fā)和甲，病原體主要以皮膚癬菌為主，其次是念珠菌，且現(xiàn)在念珠菌感染有逐漸上升趨勢(shì)[18,19]?，F(xiàn)因多種因素導(dǎo)致淺部真菌感染的發(fā)生越來越多，雖然危害小，但也嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[20]。同時(shí)因?yàn)榛颊卟灰?guī)范用藥，誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生，也為臨床診斷和治療增加了困難。而開發(fā)高效、低毒、廣譜且廉價(jià)的抗真菌藥物是全球關(guān)注的熱點(diǎn)。

6a:對(duì)照組中的白念珠菌表現(xiàn)出典型的球狀形狀，細(xì)胞壁完整且光滑；6b、6c:光照組和材料組的白念珠菌未見明顯改變；6d:實(shí)驗(yàn)組白念珠菌細(xì)胞表面變得粗糙及皺縮

N-Carbon nanozyme作為新興的納米酶，可以調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生和清除，雜原子氮摻雜和石墨結(jié)構(gòu)都是實(shí)現(xiàn)上述類酶活性的必要條件，而其結(jié)構(gòu)的多孔性提高了它們的活性。因?yàn)槎嗫捉缑嫣峁┝舜罅康幕钚晕稽c(diǎn)，有利于催化過程中的質(zhì)量運(yùn)輸[10]。同時(shí)碳納米材料能吸收某種波段的光尤其是NIR的能量，通過等離子體共振或者能量躍遷帶，將吸收的光轉(zhuǎn)化為熱能，從而導(dǎo)致局部高溫[21]。

本研究表明，N-Carbon nanozyme聯(lián)合近紅外光對(duì)白念珠菌及紅色毛癬菌均有明顯的抗菌作用，通過吸收光能迅速轉(zhuǎn)換為熱能，導(dǎo)致真菌細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的破壞。但因?yàn)樗〖訜岬囊志Ч黠@不如N-Carbon nanozyme聯(lián)合NIR的抑菌效果，因此，我們需要深入分析NIR照射N-Carbon nanozyme后產(chǎn)生的熱量對(duì)真菌活力的影響。首先，使用水浴的加熱方式是外部的；NIR照射時(shí)的加熱是內(nèi)部的，濃縮在N-Carbon nanozyme的表面上。而且，在某些時(shí)候，N-Carbon nanozyme的表面溫度可能高于本體溶液中的溫度。此外，N-Carbon nanozyme還可能黏附在真菌壁上，這種相對(duì)較高的表面溫度有利于破壞細(xì)胞壁，最終殺死真菌。其次，這兩條加熱路線之間的差異也提醒我們，加熱可能不是光熱抗菌療法的唯一因素?？紤]到N-Carbon nanozyme在一定條件下表現(xiàn)出多種酶樣活性，推測(cè)其抗真菌的機(jī)制除熱損傷外還包括：(1)高水平ROS破壞真菌膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)滲漏，致使真菌細(xì)胞失活。同時(shí)，DNA也受影響而裂解；(2)可能破壞真菌體內(nèi)的氧化還原平衡，導(dǎo)致真菌快速死亡[22]。不過具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。N-Carbon nanozyme經(jīng)NIR照射8 min誘導(dǎo)的溫度約為50℃，而人體皮膚的最高耐受溫度約為46℃，因此我們后續(xù)需要在材料上或光照參數(shù)上進(jìn)一步優(yōu)化，以期實(shí)現(xiàn)在機(jī)體耐受溫度范圍內(nèi)達(dá)到最佳抗真菌效果。本研究中關(guān)于N-Carbon nanozyme抗紅色毛癬菌無直觀的抑菌效果分析，主要限于紅色毛癬菌的形態(tài)特異性、材料的顆粒性和有色性以及808 nm激光器照光條件(光斑直徑約5 mm)，無法使用常規(guī)的抗真菌藥敏試驗(yàn)M38-A2方案及平板計(jì)數(shù)法等多種方法，需要探索其他切實(shí)可行的方法來驗(yàn)證N-Carbon nanozyme聯(lián)合NIR抗皮膚癬菌的效果。

綠色定位所有紅色毛癬菌，紅色代表死亡紅色毛癬菌；其中空白對(duì)照組、光照組和材料組可見少量紅色熒光，試驗(yàn)組見大量紅色熒光

我們的研究結(jié)果初步表明N-Carbon nanozyme聯(lián)合NIR對(duì)白念珠菌及紅色毛癬菌均有明顯的抑制效果，但如何選擇材料的濃度及NIR的能量密度、時(shí)長(zhǎng)等是關(guān)鍵，需要做到對(duì)真菌造成最大損傷的同時(shí)盡可能減小對(duì)人體的傷害。目前已有研究報(bào)道在鐵蛋白的引導(dǎo)下，N-Carbon nanozyme在人類腫瘤異種移植小鼠模型的體內(nèi)試驗(yàn)中能靶向腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生活性氧，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞，重要的是，N-Carbon nanozyme在生理?xiàng)l件下會(huì)降解[10]。那么我們也可以試想，是否也可以運(yùn)用某種靶向因子，特定作用于真菌細(xì)胞，減少對(duì)宿主的傷害，而皮膚淺表真菌感染位于體表，應(yīng)用相對(duì)容易實(shí)現(xiàn)，也比較安全。因此，N-Carbon nanozyme聯(lián)合NIR抗真菌是一個(gè)研究方向，具有潛在的應(yīng)用前景。