李大偉，張峰波，李智偉，江曉明，沙桐，趙驍，陳志強(qiáng)，丁劍冰，

1 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，烏魯木齊830054；2 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3 新疆醫(yī)科大學(xué)

布魯氏菌病是由布魯氏菌感染引起的一種人畜共患傳染病，全球每年約有50萬新發(fā)病例[1-4]。布魯氏菌病臨床癥狀不典型，極易誤診或漏診，從而造成多系統(tǒng)、多器官慢性損傷，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[5-8]。因此，研發(fā)針對(duì)布魯氏菌的疫苗能夠有效降低布魯氏菌病的發(fā)生率，但目前針對(duì)布魯氏菌的滅活疫苗和減毒活疫苗還存在諸多不足，如效果不佳、不良反應(yīng)多[9]。外膜蛋白2b(Omp2b)是布魯氏菌重要的免疫原性蛋白，屬于菌體外膜脂蛋白，存在于已知所有的菌屬中。Omp2b蛋白具有良好的抗原性與免疫原性，可刺激體液免疫，對(duì)細(xì)胞免疫亦有一定刺激作用。在疫苗研制過程中，Omp2b蛋白被認(rèn)為是一種較為理想的疫苗分子，近年來受到廣泛關(guān)注。但目前關(guān)于Omp2b蛋白抗原特異性與表位的研究較少。2017年6月—2019年8月，本研究對(duì)布魯氏菌Omp2b蛋白的抗原表位進(jìn)行了生物信息學(xué)分析?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 氨基酸序列：羊布魯氏菌Omp2b，GenBank：AMM72579.1，長度362 bp，蛋白氨基酸序列：MNIKSLLLGSAAALVAASGAQAADAIVAPEPEAVEY-VRVCDAYGAGYFYIPGTETCLRVHGYVRYDVKGGD-DVYSGTDRNGWDKGARFALRVSTGSETELGTLKTFT-ELRFNYAANNSGVDGKYGNETSSGTVMEFAYIQLGG-LRVGIDESEFHTFTGYLGDVINDDVISAGSYRTGKIAY-TFTGGNGFSAVIALEQGGDNDGGYTGTTNYHIDGYM-PDVVGGLKYAGGWGSIAGVVAYDSVIEEWAAKVRG-DVNITDQFSVWLQGAYSSAATPDQNYGQWGGDWAV-WGGLKYQATQKAAFNLQAAHDDWGKTAVTANVAY-ELVPGFTVTPEVSYTKFGGEWKNTVAEDNAWGGIV-RFQRSF。生物信息學(xué)分析軟件：ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)，SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)，DNAStar(http：//www.dnastar.com)，IEDB(http：//tools.immuneepitope.org/mhci/，http：//tools.immuneepitope.org/mhcii/，http：//tools.immuneepitope.org/main/bcell/)，SYFPEITHI(http：//www.syfpeithi.de/)，SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive/)，RasMol2.7.2.1(http：//www.openrasmol.org/)，所有軟件在線獲取。

1.2 方法

1.2.1 Omp2b蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 利用ProtParam軟件分析Omp2b蛋白的氨基酸組成、不穩(wěn)定系數(shù)和疏水性等理化性質(zhì)。

1.2.2 Omp2b蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 利用SOMPA在線軟件分析Omp2b蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。

1.2.3 Omp2b蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 將Omp2b蛋白氨基酸序列錄入SWISS-MODEL在線服務(wù)器，分析蛋白氨基酸序列并組合模板，構(gòu)建Omp2b蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，用RasMol2.7.2.1軟件讀取數(shù)據(jù)并分析其三級(jí)結(jié)構(gòu)，明確Omp2b蛋白的穩(wěn)定性。

1.2.4 Omp2b蛋白B、T細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 利用IEDB、DNAStar軟件預(yù)測(cè)Omp2b蛋白的B細(xì)胞抗原表位；利用SYFPEITHI、IEDB軟件預(yù)測(cè)Omp2b蛋白的T細(xì)胞抗原表位。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類分子選擇HLA-A*1101，MHC Ⅱ分子選擇HLA-DRB1*0701，通過比較分析最終確定Omp2b蛋白的B、T細(xì)胞抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 Omp2b蛋白的理化性質(zhì) 經(jīng)ProtParam軟件分析，Omp2b蛋白是一種由362個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，不穩(wěn)定系數(shù)為23.54，疏水性為-0.200，屬于一種穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)。

2.2 Omp2b蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu) SOMPA在線軟件分析顯示，在Omp2b蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋占23.76%，β折疊占27.90%，β轉(zhuǎn)角占5.80%，無規(guī)卷曲占42.54%。見圖1。

圖1 Omp2b蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.3 Omp2b蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu) RasMol2.7.2.1軟件分析顯示，Omp2b蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)是環(huán)狀的，非常穩(wěn)定，更多β折疊位于蛋白質(zhì)中間；在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的上部和下部存在許多易于形成構(gòu)象表位的結(jié)構(gòu)。見圖2。

圖2 Omp2b蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)形態(tài)

2.4 Omp2b蛋白的B、T細(xì)胞抗原表位

2.4.1 Omp2b蛋白的B細(xì)胞抗原表位 IEDB在線軟件預(yù)測(cè)，在Omp2b蛋白的B細(xì)胞抗原表位中，蛋白線性表位有11個(gè)得分較高區(qū)域，其位點(diǎn)分別位于18～34、66～85、93～101、115～131、169～176、184～188、196～212、225～232、268～286、306～316、328～352；蛋白β轉(zhuǎn)角有10個(gè)得分較高區(qū)域，其位點(diǎn)分別位于195～222、65～85、110～135、270～291、40～55、168～178、330～345、158～165、183～190、225～232；蛋白表面可及性有12個(gè)得分較高區(qū)域，其位點(diǎn)分別位于72～82、270～279、62～70、121～129、291～299、197～204、206～213、332～338、341～347、109～115、172～177、306～311；蛋白骨架區(qū)柔韌性有11個(gè)得分較高區(qū)域，其位點(diǎn)分別位于65～85、115～135、90～110、195～210、270～283、335～350、250～260、170～179、150～155、50～57、30～35；蛋白抗原指數(shù)有12個(gè)得分較高區(qū)域，其位點(diǎn)分別位于23～43、4～20、259～271、135～147、316～328、56～66、233～242、228～224、300～306、330～336、190～195、45～50；蛋白親水性有13個(gè)得分較高區(qū)域，其位點(diǎn)分別位于65～85、113～133、195～215、265～282、340～350、305～315、290～300、90～100、15～22、30～38、40～45、50～55、150～157。

DNAStar在線軟件綜合蛋白的α螺旋、β轉(zhuǎn)角、表面可及性、骨架區(qū)柔韌性和抗原指數(shù)五個(gè)方面預(yù)測(cè)Omp2b蛋白的B細(xì)胞抗原表位(見圖3)，結(jié)合IEDB在線軟件分析的線性表位、表面可及性、β轉(zhuǎn)角、骨架區(qū)柔韌性、抗原指數(shù)、親水性六個(gè)方面，確定了Omp2b蛋白8個(gè)B細(xì)胞抗原表位，見表1。

注：A為α螺旋區(qū)域，B為β折疊區(qū)域，T為β轉(zhuǎn)角，C為無規(guī)卷曲區(qū)域。

表1 Omp2b蛋白的B細(xì)胞抗原表位

2.4.2 Omp2b蛋白的T細(xì)胞抗原表位 采用SYFPEITHI和IEDB在線軟件預(yù)測(cè)Omp2b蛋白的T細(xì)胞抗原表位，以HLA-A*1101預(yù)測(cè)CTL細(xì)胞抗原表位，以HLA-DRB1*0701預(yù)測(cè)Th細(xì)胞抗原表位，結(jié)果見表2。經(jīng)綜合分析，共得到7個(gè)CTL優(yōu)勢(shì)表位和3個(gè)Th優(yōu)勢(shì)表位，見表3。

表2 SYFPEITHI和IEDB軟件預(yù)測(cè)的Omp2b蛋白CTL與Th表位

表3 Omp2b蛋白的T細(xì)胞抗原表位

3 討論

布魯氏菌病是由布魯氏菌感染引起的一種人畜共患傳染病。布魯氏菌可通過多種途徑傳播，侵襲力和致病力強(qiáng)，臨床癥狀不典型，能夠引起多系統(tǒng)、多器官慢性損傷。近年來，全球布魯氏菌病疫情防控形勢(shì)嚴(yán)峻，每年大約有50萬新發(fā)病例。布魯氏菌病在我國大部分省市自治區(qū)有不同程度流行，特別是畜牧業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)。新疆維吾爾自治區(qū)是全國五大牧區(qū)之一，近年來布魯氏菌病的發(fā)病率持續(xù)上升。布魯氏菌病病情難以控制，存在較多并發(fā)癥，如治療不及時(shí)易轉(zhuǎn)入慢性期，反復(fù)發(fā)作，遷延數(shù)年甚至終生不愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，布魯氏菌病的防治工作在世界范圍內(nèi)備受關(guān)注。研發(fā)針對(duì)布魯氏菌的疫苗能夠有效降低布魯氏菌病的發(fā)生率，但目前針對(duì)布魯氏菌的滅活疫苗和減毒活疫苗還存在諸多不足，如效果不佳、不良反應(yīng)多[9]。

布魯氏菌的外膜蛋白是近年來的研究熱點(diǎn)。有研究顯示，外膜蛋白屬于保護(hù)性抗原，具有免疫原性，布魯氏菌的外膜蛋白不僅是最重要的血清學(xué)診斷抗原，也是一個(gè)主要的毒力因子。外膜蛋白能夠維持布魯氏菌的正常結(jié)構(gòu)和基本功能，在布魯氏菌生存中發(fā)揮重要作用，其功能涉及侵襲、遷移和復(fù)制等與生存相關(guān)的多個(gè)環(huán)節(jié)。Omp2b蛋白是普遍存在于布魯氏菌中的一種外膜蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為36 kDa。蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Omp2b作為構(gòu)成跨膜通道的膜孔蛋白，是主要的外膜蛋白之一。通過生物信息學(xué)工具對(duì)Omp2b蛋白的B、T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，并經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Omp2b蛋白能夠引起較強(qiáng)的Th1型免疫反應(yīng)，可作為診斷布魯氏菌病的候選抗原之一。

開發(fā)有效的抗布魯氏菌病疫苗是當(dāng)前階段研究的重點(diǎn)。而疫苗受蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響較大[10]，故探索布魯氏菌Omp2b蛋白的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)疫苗研發(fā)具有重要意義。本研究對(duì)Omp2b蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Omp2b蛋白是一種穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)。在蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，β轉(zhuǎn)角區(qū)域和無規(guī)卷曲區(qū)域有利于形成表位區(qū)域[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在Omp2b蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲和β轉(zhuǎn)角構(gòu)成較多。本研究通過SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)并構(gòu)建Omp2b蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Omp2b蛋白是環(huán)狀的，非常穩(wěn)定，其表位主要位于三級(jí)結(jié)構(gòu)的上部和下部。以上研究表明，Omp2b蛋白的結(jié)構(gòu)具有疫苗研發(fā)所需的特性。

有效的疫苗不僅應(yīng)具有合理的蛋白結(jié)構(gòu)，還應(yīng)具有相應(yīng)的T、B細(xì)胞抗原表位。T細(xì)胞抗原表位必須能夠加工成與相應(yīng)MHC結(jié)合的肽，然后被TCR識(shí)別[12]。T細(xì)胞抗原表位分別由CTL和Th細(xì)胞識(shí)別的MHC Ⅰ、Ⅱ類分子呈遞。布魯氏菌是一種細(xì)胞內(nèi)病原體，細(xì)胞免疫在去除致病菌方面起著重要作用[13]。本研究使用SYFPEITHI、IEDB軟件分析了Omp2b蛋白的T細(xì)胞抗原表位，由于HLA-A*1101、HLA-DRB1*0701在新疆人群中出現(xiàn)的頻率較高，故以HLA-A*1101預(yù)測(cè)CTL細(xì)胞抗原表位，以HLA-DRB1*0701預(yù)測(cè)Th細(xì)胞抗原表位[14-16]，最后篩選出了Omp2b蛋白7個(gè)CTL優(yōu)勢(shì)表位和3個(gè)Th優(yōu)勢(shì)表位。B細(xì)胞產(chǎn)生的特異性抗體可有效識(shí)別病原體并引起隨后的一系列免疫應(yīng)答。因此，B細(xì)胞抗原表位在疫苗研發(fā)中具有重要作用[17-18]。本研究通過DNAStar、IEDB軟件確定了Omp2b蛋白的8個(gè)B細(xì)胞抗原表位。

綜上所述，布魯氏菌Omp2b蛋白具有7個(gè)CTL優(yōu)勢(shì)表位、3個(gè)Th優(yōu)勢(shì)表位和8個(gè)B細(xì)胞抗原表位，具有良好的免疫原性。這為布魯氏菌病診斷和疫苗研發(fā)提供了一定理論依據(jù)。