侯秋蘋，任妍，付敏，張麗麗

作者單位：1重慶市第十三人民醫(yī)院兒科，重慶400053；2成都市婦女兒童中心醫(yī)院兒科，四川 成都610074

兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋcute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種常見的惡性疾病，盡管現(xiàn)代治療技術(shù)得到顯著的改進(jìn)，其臨床治愈率不斷提高，但ALL病人的復(fù)發(fā)率較高，且仍有部分病人不能得到有效治愈［1-2］。因此研究ALL發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有重要的意義，有必要尋找靶向診斷、治療的分子標(biāo)志物，從而提高ALL病人的治療效果和預(yù)后復(fù)發(fā)率。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)約18～25核苷酸的非編碼單鏈RNA，通過與下游靶基因3’端非翻譯區(qū)（Untranslated region，3’UTR）特異性結(jié)合，從而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平，抑制或直接降解其mRNA，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)量，參與細(xì)胞的增殖、遷移等多種生物學(xué)過程［3-5］。miR-34a被證實(shí)在多種腫瘤病理演進(jìn)過程中發(fā)揮重要的作用，如胃癌［6］、肺腺癌［7］、甲狀腺癌［8］等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在ALL發(fā)生發(fā)展過程中表達(dá)量明顯異常，表明miRNA在ALL發(fā)生、惡化等病理進(jìn)程有相關(guān)性［9-10］。為探究miR-34a在ALL的作用及分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)miR-34a在臨床樣本中的表達(dá)量，并上調(diào)miR-34a的表達(dá)量，觀察細(xì)胞的增殖、遷移特性的變化，并初步預(yù)測(cè)和驗(yàn)證miR-34a的靶基因，為進(jìn)一步探究miR-34a作為ALL的臨床診斷、治療潛在標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料兒童ALL細(xì)胞CEM/C1購(gòu)于北納生物公司，Trizol試劑購(gòu)于大連寶生物工程有限公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）購(gòu)于北京天根生物有限公司，CCK-8試劑盒購(gòu)于日本同仁堂公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司，miR-34a模擬物以及陰性對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司。酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Tek instruments Inc公司，qPCR擴(kuò)增儀購(gòu)于美國(guó)MJ Reasearch公司。

1.2樣本的收集骨髓樣本來自重慶市第十三人民醫(yī)院血液科2017年10月至2018年12月住院的32例ALL病兒，免疫學(xué)分型診斷結(jié)果為T-ALL 12例，B-ALL 20例；所有病人均經(jīng)過形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)檢查確診，且均為初次治療的ALL病人。對(duì)照組選取該院同期25例原發(fā)性血小板減少癥病兒的骨髓樣本作為對(duì)照組，本研究已獲得病兒監(jiān)護(hù)人的知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.3細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染CEM/C1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱孵育，每2～3天加入胰酶消化、傳代。選取對(duì)數(shù)期CEM/C1細(xì)胞，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、陰性對(duì)照（Negative control，NC）組、miR-34a組。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，NC組、miR-34a組CEM/C1細(xì)胞根據(jù)Lipofectamine 2000說明書的指示下，將陰性對(duì)照和miR-34a模擬物轉(zhuǎn)染入CEM/C1細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h備用。

1.4 qPCR實(shí)驗(yàn)將骨髓樣本加入紅細(xì)胞裂解液以及收集對(duì)照組、NC組、miR-34a組轉(zhuǎn)染24 h后的CEM/C1細(xì)胞，加入Trizol試劑提取總RNA，采用PCR擴(kuò)增儀合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。以U6為參照，2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。qPCR 擴(kuò)增體系為95 ℃ 7 min，95℃ 15 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，miR-34a以及U6擴(kuò)增引物均由美國(guó)Invitrogen合成，miR-34a正向引物序列：5’-CGGTATCATTTGGCAGTGTCT-3’，反向引物序列：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6正向引物序列：5’-GCAGACCGTTCGTCAACCTA-3’，反向引物序列：5’-AATTCTGTTTGCGGTGCGTC-3’。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)收集對(duì)照組、NC組、miR-34a組CEM/C1細(xì)胞，以2×104個(gè)每孔接種于96孔板，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，在各自時(shí)間點(diǎn)提前4 h加入10微升/孔CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，置于酶標(biāo)儀檢測(cè)CEM/C1細(xì)胞570 nm吸光度。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)收集各組轉(zhuǎn)染24 h的CEM/C1細(xì)胞，更換為無血清培養(yǎng)基，將含有4×104個(gè)CEM/C1細(xì)胞的懸浮液加入Transwell上室，下室加入500μL含10%胎牛血清培養(yǎng)基，37℃孵育24 h；棉簽輕拭Transwell上室多余CEM/C1細(xì)胞，選取5個(gè)區(qū)域（上下左右中）計(jì)數(shù)，取平均值。

1.7靶基因預(yù)測(cè)和驗(yàn)證采用在線軟件TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）預(yù)測(cè)miR-34a與Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）的靶向關(guān)系。野生型（KLF4-wt）和突變型（KLF4-mut）雙熒光素酶載體由上海吉?jiǎng)P基因公司合成，在雙熒光素酶試劑盒說明書指示下，KLF4-wt和KLF4-mut分別與miR-34a模擬物、陰性對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，37℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定CEM/C1細(xì)胞中雙熒光素酶的相對(duì)活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表示為，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢測(cè)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-34a在ALL骨髓樣本中的表達(dá)量qPCR檢測(cè)miR-34a在ALL骨髓樣本中的表達(dá)量，與對(duì)照組（1.00±0.08）相比，miR-34a在ALL骨髓樣本中的表達(dá)量（0.33±0.05）下調(diào)（t＝15.680，P＜0.001）。

2.2轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物對(duì)CEM/C1細(xì)胞中miR-34a表達(dá)量的影響qPCR檢測(cè)CEM/C1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物對(duì)miR-34a表達(dá)量的影響，與對(duì)照組（1.00±0.08）相比，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照對(duì)CEM/C1細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)量（0.99±0.08）無明顯影響，但轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物可上調(diào)CEM/C1細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)量（3.21±0.23）（F＝423.135，P＜0.001）。

2.3上調(diào)miR-34a對(duì)CEM/C1細(xì)胞增殖的影響CCK-8檢測(cè)上調(diào)miR-34a對(duì)CEM/C1細(xì)胞增殖的影響，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照對(duì)CEM/C1細(xì)胞增殖無明顯影響，但上調(diào)miR-34a的表達(dá)量明顯抑制CEM/C1細(xì)胞增殖（P＜0.05）。見表1。

表1 CCK-8檢測(cè)上調(diào)微小RNA-34a（miR-34a）對(duì)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞CEM/C1增殖的影響/

表1 CCK-8檢測(cè)上調(diào)微小RNA-34a（miR-34a）對(duì)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞CEM/C1增殖的影響/

注：NC為陰性對(duì)照。與對(duì)照組相比，aP＜0.05

組別對(duì)照組NC組miR-34a組F值P值CEM/C1 72 h 1.08±0.09 1.12±0.10 0.73±0.08a 29.081＜0.001重復(fù)次數(shù)6 6 6 24 h 0.29±0.03 0.30±0.03 0.28±0.03 0.841 0.451 48 h 0.65±0.05 0.69±0.06 0.42±0.04a 40.818＜0.001

2.4上調(diào)miR-34a對(duì)CEM/C1細(xì)胞遷移的影響Transwell檢測(cè)上調(diào)miR-34a對(duì)CEM/C1細(xì)胞遷移的影響，與對(duì)照組（142.36±12.47）個(gè)相比，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照對(duì)CEM/C1細(xì)胞遷移（137.45±13.49）個(gè)無明顯影響，但上調(diào)miR-34a的表達(dá)量降低CEM/C1細(xì)胞遷移數(shù)（79.89±6.23）個(gè)（F＝57.683，P＜0.05）。

2.5靶基因的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證在線軟件TargetScan預(yù)測(cè)miR-34a的潛在靶基因，結(jié)果如圖1所示，KLF4基因3’UTR具有靶向結(jié)合于miR-34a的堿基。進(jìn)一步通過雙熒光素酶驗(yàn)證報(bào)告驗(yàn)證，上調(diào)miR-34a與KLF4-wt共轉(zhuǎn)染入CEM/C1細(xì)胞（0.45±0.03）較NC組與KLF4-wt共轉(zhuǎn)染（1.00±0.06）顯著降低雙熒光素酶活性（t＝20.083，P＜0.001）；但上調(diào) miR-34a與KLF4-mut共轉(zhuǎn)染（1.03±0.07）較NC組與KLF4-wt共轉(zhuǎn)染（1.01±0.07）對(duì)CEM/C1細(xì)胞雙熒光素酶相對(duì)活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.495，P＝0.631）。

圖1 在線軟件TargetScan預(yù)測(cè)微小RNA-34a（miR-34a）與Krüppel樣因子4（KLF4）的靶向關(guān)系

3 討論

近年來，盡管ALL的臨床治療技術(shù)得到顯著的提高，但化療藥物易產(chǎn)生耐藥性以及預(yù)后生存率尚需進(jìn)一步提高等問題嚴(yán)重制約著ALL的臨床治療效果。分子靶向治療具有特異性高、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，因此探究ALL分子靶向治療的標(biāo)志物具有重要的意義。目前已有大量研究表明miRNA在血液系統(tǒng)性疾病中發(fā)揮重要的作用［11-12］。如miR-153能夠直接靶向磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路，調(diào)控Jurkat細(xì)胞增殖和凋亡［13］。miR-144可抑制兒童ALL細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，可為兒童ALL治療提供新的靶點(diǎn)［14］。上述研究結(jié)果均表明，miRNA通過調(diào)控細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性，影響ALL的發(fā)生發(fā)展，是ALL分子靶向治療的潛在標(biāo)志物，但其具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。miR-34a在急性髓細(xì)胞白血?。ˋcute myeloid leukemia，AML）組織中表達(dá)量明顯下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞侵襲，可作為AML病人臨床診斷、預(yù)后的潛在標(biāo)志物［15］。在本實(shí)驗(yàn)中，miR-34a在ALL病人骨髓樣本中較對(duì)照組明顯下調(diào)，與AML表達(dá)量相同，表明miR-34a參與白血病的病理進(jìn)程；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-34a的表達(dá)量可明顯抑制CEM/C1細(xì)胞的增殖、遷移，表明在ALL發(fā)生發(fā)展過程中，上調(diào)miR-34a可通過抑制細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性阻礙ALL的病理進(jìn)程，靶向增加miR-34a的表達(dá)量可能成為一種治療ALL的新方法，但尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究miR-34a的具體作用。

KLF4基因位于人染色體9q31，在消化道、內(nèi)皮細(xì)胞、口腔等廣泛表達(dá)，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生物學(xué)過程。研究報(bào)道沉默KLF4可有效抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡［16］。KLF4的上調(diào)抑制了胃癌細(xì)胞增殖和集落形成能力，并促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡［17］。KLF4在小兒T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病中具有抑制功能［18］。KLF4過表達(dá)能抑制人慢性髓系白血病細(xì)胞K562的增殖及遷移能力［19］。在本實(shí)驗(yàn)中，為探究miR-34a調(diào)控ALL細(xì)胞增殖、遷移的作用機(jī)制，通過在線數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-34a與KLF4 3’UTR部分靶基因特異性結(jié)合，表明KLF4可能是miR-34a的靶基因之一；雙熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-34a與KLF4-wt共轉(zhuǎn)染降低CEM/C1細(xì)胞中雙熒光素酶的相對(duì)表達(dá)量，而與KLF4-mut共轉(zhuǎn)染對(duì)CEM/C1細(xì)胞中雙熒光素酶的相對(duì)表達(dá)量無明顯影響，進(jìn)一步證實(shí)KLF4是miR-34a的靶基因，表明miR-34a可能通過調(diào)控KLF4影響CEM/C1細(xì)胞的增殖、遷移。

綜上所述，miR-34a在ALL病人骨髓樣本中表達(dá)量下調(diào)；上調(diào)miR-34a的表達(dá)量抑制CEM/C1細(xì)胞的增殖、遷移，可能是通過靶向調(diào)控KLF4發(fā)揮作用，但其具體的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。