孫艷華，李明，徐建立，董路，曹學(xué)彬，孟小晶

作者單位：滄州市人民醫(yī)院胃腸疝外科，河北 滄州061000

結(jié)腸癌是一種能夠受遺傳和環(huán)境影響的高發(fā)惡性腫瘤［1-2］，是導(dǎo)致老年人癌癥相關(guān)死亡率的主要原因［3］，大約25%～40%的病人存在腫瘤復(fù)發(fā)，導(dǎo)致結(jié)腸癌的死亡率高達40%［4-5］。紫草素（shikonin）是一種來自傳統(tǒng)中草藥——紫草（Lithospermum erythrorhizon）根部的萘醌類化合物［6］，其具有廣譜抗腫瘤活性［7］，可誘導(dǎo)細胞凋亡［8］，抑制癌細胞增殖［9］。但紫草素誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞自噬的作用機制仍不清楚。

細胞異常增殖是癌癥發(fā)生的主要特征［10-11］，自噬是一種進化上保守的可以有效維持細胞穩(wěn)態(tài)的生理過程，通過溶酶體降解細胞內(nèi)功能冗余的蛋白質(zhì)或受損細胞器［12-14］，在細胞生長、細胞分化、癌癥、感染和代謝綜合征等多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用［15-17］。在DAF-2突變體秀麗隱桿線蟲中，Beclin 1敲低使其壽命明顯縮短［18-20］。自噬相關(guān)的E1連接酶7（ATG7）是自噬囊泡延伸過程中的關(guān)鍵因子，參與了兩種必需的泛素化反應(yīng)過程［21］。ATG7對于機體發(fā)育平衡，細胞分化尤為重要［22-24］。

本研究起止時間為2017年10月至2019年6月，旨在闡明ATG7在紫草素誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞自噬過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究材料 紫草素購于Aynor Medicine Technology Co.Ltd（中國西安），純度98%；二甲基亞砜（DMSO）購于MP Biomedicals LLC（Santa Ana，CA，USA）；Trypsin-EDTA 0.25%（1×），胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)基購于Thermo Fisher Scientific（Waltham，MA，USA）；Hoechst 33258試劑盒和細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）購于Beyotime Institute of Biotechnology（中國上海）；抗體包括β-actin、磷酸化激活的c-Jun氨基末端激酶（P-JNK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、DNA修復(fù)酶（PARP）、Fas相關(guān)死亡域蛋白（FADD）、磷酸化激活的P38蛋白（p-P38）、P38蛋白（P38）、LC3B、p62、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved-Caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）和裂解的半胱氨酸蛋白酶-8（Cleaved-Caspase-8），購于Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）；細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和磷酸化激活的ERK（P-ERK）的抗體購于Beyotime Institute of Biotechnology；二抗購于Jackson ImmunoResearch Laboratorie s（West Grove，PA，USA）；RNA干擾試驗所用載體pSUPER購于Oligoengine公司，陰性對照質(zhì)粒為pSUPER_GFP siRNA，干擾pSUPER載體靶序列為5’-CCACTAGTCTGACGGATAA，ATG7干擾靶序列為5’-GCCTGCTGAGGAGCTCTCCAT。

1.2細胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞系SNU-407細胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心。正常結(jié)腸黏膜上皮細胞系NCM460細胞購于南京貝爾博有限公司。細胞培養(yǎng)條件：10%FBS，37℃，5%二氧化碳。

1.3 CCK-8檢測通過CCK-8試劑盒測定細胞存活率。細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，將其培養(yǎng)于96孔板中，每孔8×103個細胞，然后孵育過夜。將紫草素以指定濃度（0～80μmol/L）溶解在DMSO中，然后與10%FBS-DMEM混合。細胞在不同處理下培養(yǎng)24 h和48 h。向每個孔（200μL）中加入20μL CCK-8溶液，并在37℃下溫育1 h。然后，使用ELx800吸光度酶標儀測量490 nm處吸光度。

1.4 Hoechst 33258染色將蓋玻片浸泡在75%乙醇中30 min充分處理，用無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌3次，然后在六孔板中與細胞一起孵育過夜。用不同濃度（0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和30μmol/L）紫草素處理24 h。除去培養(yǎng)基后，向各孔中加入0.5 mL固定液處理10 min。棄定影液，再用PBS洗滌細胞3 min。在黑暗中用Hoechst 33258（0.5 mL）將細胞染色5 min。棄Hoechst 33258，并用PBS洗滌細胞兩次，在每個蓋玻片上加入1滴封固劑。最后，在IX71熒光顯微鏡下觀察記錄細胞生長情況。

1.5流式細胞術(shù)分析用不同濃度（0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和30μmol/L）紫草素處理細胞24 h后收集，經(jīng)PBS充分洗滌細胞，通過胰蛋白酶消化分離，并轉(zhuǎn)移到新的離心管中。離心沉降后，細胞濃度稀釋至1×105個，然后用5μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和10μL碘化丙啶（PI）在黑暗中染色20 min。立即通過Guava Easy-Cyte 6HT-2L流式細胞儀分析記錄細胞生長情況。

1.6蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）細胞在紫草素處理24 h后，用胰蛋白酶消化，獲得單細胞懸浮液并用PBS洗滌3次。使用全細胞裂解分析試劑盒（KeyGEN Biotec）提取總蛋白。然后，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)樣品。再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）微孔膜上，并用5%脫脂奶粉封閉1 h。將PVDF膜在4℃下與一抗孵育過夜：ERK（1∶1 000）、P-ERK（1∶1 000）、JNK（1∶1 000）、P-JNK（1∶1 000）、P38（1∶1 000）、p-P38（1∶1 000）、FADD（1∶1 000）、Caspase-8（1∶1 000）、Cleaved-Caspase-8（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Cleaved-Caspase-3（1∶1 000）、PARP（1∶1 000）、裂解的DNA修復(fù)酶（Cleaved PARP，1∶1 000）、自噬分子標記物LC3B（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）。用1×磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌3次后，將膜與稀釋的二抗一起溫育1 h。再次洗滌3次后，使用增強化學(xué)發(fā)光溶液（Thermo Fisher Scientific）檢測印跡。使用X射線膠片處理器（Taixing Suxing Company）拍照記錄。經(jīng)NIH成像程序（ImageJ）分析每種蛋白質(zhì)的吸光度。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法本研究中每一實驗結(jié)果至少包括3次重復(fù)獨立實驗，數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5.0軟件分析。所得數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1紫草素抑制人結(jié)腸癌細胞系SNU-407細胞增殖人結(jié)腸癌細胞系SNU-407細胞經(jīng)不同濃度梯度的紫草素處理24 h和48 h后，通過CCK-8測定檢查細胞活力。檢測結(jié)果表明，在24 h和48 h時，紫草素對SNU-407細胞的50%生長抑制值（GI50）分別為（18.20±0.17）μmol/L和（12.90±0.32）μmol/L。同時，在低于35μmol/L紫草素范圍內(nèi)，正常結(jié)腸黏膜上皮細胞系NCM460細胞生長不受影響，在24 h和48 h時紫草素對NCM460細胞的GI50值分別為（57.96±0.36）μmol/L和（53.81±0.33）μmol/L。見表1。

2.2紫草素誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞系SNU-407細胞凋亡通過Hoechst 33258染色觀察不同濃度梯度紫草素處理SNU-407細胞后，細胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化特征。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，紫草素處理組細胞內(nèi)凋亡小體明顯增多（圖1A）。此外，流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示紫草素誘導(dǎo)SNU-407胞凋亡：紫草素處理24 h后，早期和晚期凋亡細胞的百分比顯著增加；在紫草素暴露24 h后，早期凋亡細胞的百分比從3.09%增加至21.59%。隨著紫草素濃度的增加，晚期凋亡細胞的百分比也明顯增加（圖1B）。

表1 不同濃度紫草素抑制結(jié)腸癌細胞增殖情況/（%，）

表1 不同濃度紫草素抑制結(jié)腸癌細胞增殖情況/（%，）

注：SNU-407屬人結(jié)腸癌細胞系，NCM460屬正常結(jié)腸黏膜上皮細胞系。與0μmol/L紫草素相比，aP＜0.001

SNU-407細胞相對存活率NCM460細胞相對存活率紫草素0μmol/L 5μmol/L 10μmol/L 15μmol/L 20μmol/L 25μmol/L 30μmol/L 35μmol/L 40μmol/L 45μmol/L 50μmol/L 55μmol/L 60μmol/L 65μmol/L 70μmol/L 75μmol/L 80μmol/L 48 h 100 103.40±0.54 101.54±1.65 99.54±1.25 97.54±1.69 95.14±1.77 93.17±2.11 91.24±1.55 88.15±2.13a 83.12±1.47a 65.14±2.13a 48.24±2.17a 43.17±2.14a 40.14±1.22a 39.47±1.21a 39.12±0.87a 39.04±1.12a 24 h 100 82.51±1.21a 72.15±1.54a 63.21±0.87a 48.26±0.87a 43.15±1.54a 40.21±2.21a 37.12±2.14a 32.14±1.21a 28.47±2.21a 26.47±1.54a 23.58±2.14a 21.14±1.54a 19.57±2.66a 19.54±1.77a 18.54±1.25a 18.51±0.87a 48 h 100 75.21±1.11a 63.54±0.57a 45.59±0.76a 40.42±1.11a 35.41±1.88a 32.14±1.87a 30.74±2.21a 25.14±2.14a 22.47±2.14a 20.46±2.65a 18.54±1.54a 16.47±2.54a 15.47±1.47a 14.87±2.13a 14.33±1.29a 13.88±1.47a 24 h 100 105.20±0.24 108.24±1.55 103.57±1.22 101.25±1.58 98.58±1.66 96.25±1.44 93.21±1.47 90.21±2.13 85.14±1.33a 75.14±1.36a 53.14±1.56a 49.25±2.14a 43.14±1.54a 41.25±1.47a 40.14±0.87a 39.14±0.28a

2.3紫草素激活了死亡受體途徑蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，隨著紫草素濃度的增加，F(xiàn)ADD的表達增強（P＜0.05），而紫草素處理組細胞PARP表達水平?jīng)]有明顯變化（P＜0.05），但紫草素處理組細胞中裂解的PARP蛋白水平顯著增加（P＜0.05）。此外，與對照組相比，紫草素處理組Caspase-8和Caspase-3蛋白表達水平?jīng)]有顯著變化（P＜0.05），而裂解的Caspase-8和Caspase-3蛋白含量顯著增加（P＜0.05）。見圖2、表2。

2.4紫草素激活了絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑紫草素處理對SNU-407細胞MAPK途徑關(guān)鍵蛋白的蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，與0μmol/L紫草素濃度組相比，隨著紫草素濃度的增加，P-ERK、P-JNK和p-P38蛋白的表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），ERK、JNK和P38蛋白的表達水平均為發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。此外，還檢測了B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）蛋白表達情況。與對照組相比，紫草素處理組中Bax水平明顯上調(diào)，Bcl-2的表達顯著降低（P＜0.05）。見圖3、表3。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測不同濃度紫草素誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞SNU-407中死亡受體途徑相關(guān)蛋白：A為FADD、PARP及Cleaved PARP檢測結(jié)果；B為Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Caspase-8、Cleaved Caspase-8檢測結(jié)果

表2 不同濃度紫草素誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞SNU-407中死亡受體途徑相關(guān)蛋白蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果比較/

表2 不同濃度紫草素誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞SNU-407中死亡受體途徑相關(guān)蛋白蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果比較/

注：FADD為Fas相關(guān)死亡域蛋白，PARP為DNA修復(fù)酶，Cleaved PARP為裂解的DNA修復(fù)酶，Caspase-3為半胱氨酸蛋白酶-3，Cleaved Caspase-3為裂解的半胱氨酸蛋白酶-3，Caspase-8為半胱氨酸蛋白酶-8，Cleaved Caspase-8為裂解的半胱氨酸蛋白酶-8。與0μmol/L紫草素相比，aP＜0.05

Cleaved Caspase-8 0.1±0.08 0.13±0.04a 0.19±0.03a 0.48±0.14a 21.263 0.011紫草素0μmol/L 10μmol/L 20μmol/L 30μmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 FADD 0.25±0.1 0.55±0.08a 0.75±0.12a 0.89±0.11a 31.886 0.003 PARP 0.95±0.12 0.93±0.08 0.95±0.06 0.96±0.07 0.333 0.803 Cleaved PARP 0.12±0.08 0.2±0.06a 0.25±0.08a 0.36±0.12a 11.246 0.023 Caspase-3 0.92±0.12 0.91±0.06 0.94±0.05 0.93±0.07 0.436 0.763 Cleaved Caspase-3 0.25±0.12 0.56±0.13a 0.83±0.08a 0.98±0.13a 32.886＜0.001 Caspase-8 0.92±0.02 0.94±0.11 0.95±0.13 0.94±0.07 0.376 0.795

表3 不同濃度紫草素處理對人結(jié)腸癌細胞SNU-407絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號傳導(dǎo)途徑中各蛋白蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果比較/

表3 不同濃度紫草素處理對人結(jié)腸癌細胞SNU-407絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號傳導(dǎo)途徑中各蛋白蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果比較/

注：ERK為細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，p-ERK為磷酸化激活的ERK，JNK為c-Jun氨基末端激酶，p-JNK為磷酸化激活的c-Jun氨基末端激酶，P38為P38蛋白，p-P38為磷酸化激活的P38蛋白，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白。與0μmol/L紫草素相比，aP＜0.05

Bcl-2 0.82±0.02 0.84±0.11a 0.75±0.13a 0.54±0.07a 12.113 0.024紫草素0μmol/L 10μmol/L 20μmol/L 30μmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 ERK 0.93±0.11 0.83±0.13 0.91±0.10 0.89±0.13 0.547 0.670 p-ERK 0.12±0.11 0.16±0.13a 0.25±0.14a 0.88±0.19a 38.474＜0.001 JNK 0.92±0.02 0.83±0.08 0.91±0.13 0.82±0.11 0.531 0.465 p-JNK 0.15±0.11 0.21±0.13a 0.33±0.14a 0.90±0.19a 63.064＜0.001 P38 0.96±0.11 0.95±0.13 0.97±0.10 0.98±0.13 0.312 0.814 p-P38 0.54±0.21 0.77±0.12a 1.34±0.05a 1.93±0.07a 132.463＜0.001 Bax 0.25±0.12 0.15±0.13a 1.23±0.08a 1.98±0.13a 135.885＜0.001

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測不同濃度紫草素處理對人結(jié)腸癌細胞SNU-407絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號傳導(dǎo)途徑中各蛋白表達

2.5紫草素誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞系SNU-407細胞自噬在對紫草素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞自噬的檢測中，SNU-407細胞經(jīng)紫草素處理后，ATG5的蛋白質(zhì)表達水平?jīng)]有明顯變化，然而，隨著紫草素濃度的增加，ATG7蛋白表達水平明顯增強，p62表達水平顯著下調(diào)；10μmol/L、20μmol/L和30μmol/L紫草素處理后SNU-407細胞的ATG7/ATG5相對表達量分別為（176±9）%、（212±13）%和（293±11）%，與0 μmol/L紫草素處理組相比均顯著增加（P＜0.05）。見圖4。

2.6 ATG7沉默抑制紫草素誘導(dǎo)的細胞自噬通過構(gòu)建ATG7的RNA干擾質(zhì)粒pSUPER_ATG7 siRNA（shATG7），轉(zhuǎn)染SNU-407細胞后，經(jīng)紫草素處理，與陰性對照質(zhì)粒pSUPER_GFP siRNA（GFPi）轉(zhuǎn)染細胞比較LC3-Ⅱ的激活情況。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，細胞自噬基因ATG7表達水平隨紫草素濃度升高而增加，見圖5A、表4。經(jīng)20μmol/L紫草素處理后，ATG被沉默的shATG7組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著低于GFPi陰性對照組［（8.25±1.36）比（97.45±1.98），P＜0.001］，LC3-Ⅱ的激活受到抑制，見圖5B。

圖4 不同濃度紫草素處理的SNU-407細胞中自噬相關(guān)的E1連接酶5（ATG5）、自噬相關(guān)的E1連接酶7（ATG7）和p62蛋白的表達

表4 自噬相關(guān)的E1連接酶7（ATG7）的沉默抑制不同濃度紫草素誘導(dǎo)的細胞自噬結(jié)果比較/

表4 自噬相關(guān)的E1連接酶7（ATG7）的沉默抑制不同濃度紫草素誘導(dǎo)的細胞自噬結(jié)果比較/

注：Beclin-1和ATG7均為自噬相關(guān)蛋白。與0μmol/L紫草素相比，aP＜0.05

ATG7 0.1±0.04 0.22±0.05a 0.75±0.12a 0.95±0.13a 53.648＜0.001紫草素0μmol/L 10μmol/L 20μmol/L 30μmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)NCM460SNU407 3 3 3 3 Beclin-1 0.11±0.08 0.18±0.09a 0.35±0.12a 0.45±0.11a 15.224 0.009 ATG7 0.25±0.14 0.43±0.14a 0.75±0.12a 0.93±0.13a 38.853＜0.001 Beclin-1 0.08±0.02 0.13±0.04a 0.45±0.12a 0.55±0.11a 174.649＜0.001

圖5 自噬相關(guān)的E1連接酶7（ATG7）的沉默抑制不同濃度紫草素誘導(dǎo)的細胞自噬：A為紫草素對細胞自噬基因的影響；B為ATG7干擾抑制了紫草素誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞自噬

3 討論

本研究對紫草素抗腫瘤分子機制分兩步進行。第一部分為紫草素處理24 h條件下誘導(dǎo)結(jié)腸癌SNU-407細胞凋亡，細胞凋亡作為I型程序性細胞死亡方式，是靶向腫瘤藥物實現(xiàn)細胞殺傷的最常見機制。而Ⅱ型程序性細胞死亡即細胞自噬，目前在抗腫瘤藥物治療研究領(lǐng)域仍有爭議。因此，本研究主要關(guān)注于探討紫草素誘導(dǎo)細胞自噬的分子機制。CCK-8細胞活力測定結(jié)果顯示，紫草素以濃度和時間依賴性方式抑制結(jié)腸癌細胞SNU-407增殖；通過Hoechst 33258染色觀察到紫草素處理組細胞核破裂，凋亡小體明顯增多，表明紫草素可誘導(dǎo)SNU-407細胞凋亡。進一步蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，紫草素可以激活MAPK和FADD誘導(dǎo)SNU-407細胞凋亡，并上調(diào)ATG7表達誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞自噬。以上結(jié)果為將紫草素開發(fā)成新型結(jié)腸癌治療藥物提供實驗依據(jù)。

細胞凋亡途徑可分為外在死亡受體途徑和內(nèi)在線粒體途徑［25］，外在死亡受體途徑涉及的一些相關(guān)蛋白質(zhì)，如FADD、Caspase-8和Caspase-3，其啟動后再提高PARP的表達水平［26］。在藥物等外界因素誘發(fā)凋亡時，裂解的PARP片段常用作細胞凋亡的標志物［27］。而MAPK通路的激活涉及多個細胞過程的啟動［28］。例如，激活MAPK途徑可以誘導(dǎo)細胞凋亡，這是多種化學(xué)治療藥物發(fā)揮作用的主要抗癌機制［29-30］；ERK、JNK和p38直接參與細胞凋亡［31-32］；ERK、JNK和p38的激活常與腫瘤細胞凋亡相關(guān)［33-34］。其中，JNK的活化能夠調(diào)節(jié)線粒體蛋白質(zhì)如Bcl-2來觸發(fā)細胞生理過程，例如細胞增殖和凋亡［35］。

本研究實驗結(jié)果表明，紫草素不僅增加了凋亡小體的數(shù)量，而且還激活了FADD、Caspase-3、Caspase-8和PARP，它們都參與了外源性死亡受體途徑的調(diào)節(jié)。本研究還揭示了紫草素誘導(dǎo)p38、JNK和ERK的活化和磷酸化?；谶@些結(jié)果，我們認為紫草素可通過死亡受體途徑和人結(jié)腸癌細胞中的MAPK活化誘導(dǎo)細胞凋亡以發(fā)揮抗腫瘤作用。

自噬是一種正常生理分解代謝過程，通過將受損的細胞器，半衰期長的蛋白質(zhì)和受損的蛋白質(zhì)隔離和降解，維持細胞穩(wěn)態(tài)［36］。ATG是一類專門參與細胞自噬調(diào)控的基因統(tǒng)稱，已鑒定出多種類型，分別參與細胞自噬的啟動、自噬體產(chǎn)生和降解等過程［36］。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平是自噬程度的重要標志。本研究蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示在ATG7沉默后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯低于對照組，表明ATG7是紫草素誘導(dǎo)SNU-407結(jié)腸癌細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白因子。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）和自噬是兩個截然不同且相互作用的蛋白水解系統(tǒng)。p62既是自噬底物，可用作自噬活性的報告基因。同時，p62還可將泛素化的蛋白質(zhì)（例如tau）遞送至蛋白酶體完成降解［36-37］。本研究蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，隨著紫草素濃度升高，ATG7表達水平明顯上調(diào)，p62表達水平顯著下調(diào)。這表明紫草素可激活結(jié)腸癌細胞自噬。

自噬不僅可以保護細胞免受異常細胞代謝活動的影響，并在多種病理過程中發(fā)揮腫瘤抑制作用［38-40］。在人肝癌細胞系SMMC-7721中，紫草素可以通過誘導(dǎo)自噬抑制腫瘤生長。紫草素還可誘導(dǎo)NCI-H460肺癌細胞和人骨肉瘤U2OS細胞以及H9C2細胞自噬。此外，紫草素可以通過調(diào)節(jié)一些自噬相關(guān)蛋白如Beclin-1、LC3BⅠ、LC3BⅡ、mTOR和p62來抑制雷帕霉素預(yù)處理的膠質(zhì)瘤細胞中的自噬［24］。

本研究觀察到ATG5與ATG7的比例以濃度依賴性方式增加；相反，p62的表達量隨著紫草素濃度的增加而逐漸減少；同時，ATG7是紫草素誘導(dǎo)結(jié)腸癌SNU-407細胞自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子。這些結(jié)果證明紫草素通過促進自噬體的起始，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞自噬。

（本文圖1見插圖12-1）