楊旭，王叢

(江蘇省南通市中醫(yī)院，江蘇 南通)

0 引言

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)是周圍血管、神經(jīng)病變及感染等因素綜合作用的結(jié)果，常易導(dǎo)致皮膚潰瘍，并出現(xiàn)不同程度的修復(fù)缺陷，為下肢截肢及死亡最常見的獨(dú)立危險因素[1,2]，全球發(fā)病率為6.3%，中國發(fā)病率為4.1%[3]，其病情易反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，其治療是臨床急需解決的重要難題之一。芪柏愈瘍油是治療糖尿病足潰瘍的外用藥，應(yīng)用此藥在臨床上對糖尿病足潰瘍患者進(jìn)行治療，總有效率達(dá)到88.2%，臨床治療中發(fā)現(xiàn)芪柏愈瘍油可以減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，改善肉芽組織形態(tài)，促進(jìn)血管生成。

血管生成主要包括內(nèi)皮細(xì)胞的活化、遷移和增生以及周細(xì)胞募集、包裹促進(jìn)血管成熟等幾個階段。為評估治療過程中潰瘍創(chuàng)面血管生成情況，我們采用血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)來檢測創(chuàng)面新生微血管情況。此次研究以芪柏愈瘍油為干預(yù)藥物，以糖尿病大鼠潰瘍模型為研究對象，采用Western Blot檢測方法，研究芪柏愈瘍油促進(jìn)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合的作用，進(jìn)一步明確芪柏愈瘍油對潰瘍創(chuàng)面的作用機(jī)制，為糖尿病足潰瘍的中醫(yī)外治療法提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，為更好發(fā)掘有效藥物群、研發(fā)中藥新藥提供了前期的基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物與實(shí)驗環(huán)境

SD雄性大鼠，8-10周齡，體重為150±20g，動物飼養(yǎng)及無菌手術(shù)均在動物實(shí)驗室進(jìn)行，實(shí)驗動物飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗動物普通環(huán)境及設(shè)施(編號為GB14925-200 1)》，飼養(yǎng)溫度為21±2℃，相對濕度40-70%，室內(nèi)明暗交替各12小時。SD大鼠分籠喂養(yǎng)，飼料與墊料均經(jīng)消毒處理，墊料每日更換一次，保持墊料干燥。飲用水經(jīng)煮沸后冷卻至室溫提供給動物。

1.1.2 實(shí)驗藥品

芪柏愈瘍油：中藥飲片由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提供，黃芪、黃柏、大黃、白芷、赤芍、血竭等藥物按比例配伍，制成濃度為每1mL含生藥0.85g的黃色澄清液體，密封保存。

復(fù)方紫草油：由紫草、冰片、忍冬藤、白芷組成，輔料為麻油。性狀為紫紅色澄清液體，規(guī)格為30mL/瓶。武漢健民集團(tuán)葉開泰國藥(隨州)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20044385，產(chǎn)品批號171242。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 糖尿病大鼠潰瘍模型的建立

(1)糖尿病大鼠模型的建立

雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為空白對照組(NC組)16只，糖尿病組(DM組)64只。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，于第2周注射STZ溶液，注射前所有SD大鼠需要禁食不禁水12h，造模當(dāng)日稱取所有大鼠體重，尾靜脈采血測定基礎(chǔ)血糖。按照65mg/kg的劑量對DM組大鼠一次性腹腔注射配制好的STZ溶液，建立糖尿病大鼠模型；對NC組大鼠腹腔注射等容積的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。各組大鼠于注射STZ溶液1小時后自由進(jìn)食進(jìn)水，之后每日給予大鼠充足飲水和攝食，保持墊料干燥。注射STZ溶液后3天、5天、7天分別檢測大鼠尾靜脈隨機(jī)血糖，血糖值2次或2次以上≥16.7mmol/L，則判定糖尿病大鼠模型造模成功[4]。

(2)糖尿病大鼠潰瘍模型的建立

成功建立糖尿病大鼠模型2周后制作糖尿病大鼠潰瘍模型，造模前12小時所有大鼠禁食不禁水，造模前3小時禁水，按0.3mL/100g的劑量對所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉。將麻醉后的大鼠俯臥位放在固定板上，固定住四肢，剪毛備皮，背部正中偏左側(cè)做直徑為2.0cm ×2.0cm的圓形標(biāo)記，無菌條件下用剪刀剪去標(biāo)記處全層皮膚(深達(dá)肌肉)，止血后用生理鹽水沖洗創(chuàng)面[5]。

1.2.2 分組

未注射STZ溶液的大鼠為空白對照組(NC組)，將造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組(MG組)，芪柏愈瘍油組(TG1組)、復(fù)方紫草油組(TG2組)。

1.2.3 給藥方法

(1)空白對照組(NC組)與模型組(MG組)給藥方法：碘伏消毒后，局部清創(chuàng)，用生理鹽水完全浸漬后覆蓋創(chuàng)面，外用無菌敷貼纏繞包扎，每天換藥一次。

(2)芪柏愈瘍油組(TG1組)給藥方法：碘伏消毒，局部清創(chuàng)后，用生理鹽水潤洗創(chuàng)面，將含有芪柏愈瘍油藥液的紗布濕敷于大鼠創(chuàng)面，外用無菌敷貼纏繞包扎，每天換藥一次。

(3)復(fù)方紫草油組(TG2組)給藥方法：碘伏消毒，局部清創(chuàng)后，用生理鹽水潤洗創(chuàng)面，將含有紫草油藥液的紗布濕敷于大鼠創(chuàng)面，外用無菌敷貼纏繞包扎，每天換藥一次。

1.2.4 取材

在用藥后7、14天，將大鼠麻醉后，剪取大鼠創(chuàng)面組織(包括創(chuàng)面周圍正常皮膚組織)，將組織置于無菌細(xì)胞凍存管中，于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80°冰箱中保存，用于WB檢測。

表1 不同時間點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面中CD31的蛋白表達(dá)水平(±s)

表1 不同時間點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面中CD31的蛋白表達(dá)水平(±s)

注：*與NC組相比，P＜0.05；#與MG組相比，P＜0.05。

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圖1 不同時間點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面中CD31的蛋白表達(dá)水平比較

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間方差齊采用LSD法，方差不齊采用Tamhane's T2(M)法，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。繪圖采用Graphpad 7.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 Western Blot檢測創(chuàng)面組織中CD31的表達(dá)情況

WB檢測結(jié)果顯示，用藥后7天，模型組(MG組)大鼠創(chuàng)面組織中CD31表達(dá)明顯低于空白對照組NC組 (P＜0.05)，芪柏愈瘍油組(TG1組)與復(fù)方紫草油組(TG2組)中CD31表達(dá)水平較與MG組均明顯增加(P＜0.05)，TG1組與TG2組的表達(dá)無明顯差異；藥物干預(yù)后14天，MG組大鼠創(chuàng)面組織中CD31的表達(dá)水平仍明顯低于NC組 (P＜0.05)，芪柏愈瘍油組(TG1組)與復(fù)方紫草油組(TG2組)中CD31的表達(dá)較MG組明顯增加(P＜0.05)，TG1組和TG2組未見明顯差異，見表1及圖1。(附加說明：1.MG組與NC組比較有明顯差異，說明糖尿病大鼠創(chuàng)面與正常大鼠創(chuàng)面相比，確實(shí)存在血管生成異常、創(chuàng)面愈合延遲等慢性創(chuàng)面特征，模型成立；2.芪柏愈瘍油組(TG1組)與MG組比較差異顯著，說明存在治療效果；3.復(fù)方紫草油是芪柏愈瘍油的正效對照藥，因為復(fù)方紫草油是公認(rèn)治療糖尿病創(chuàng)面愈合有效藥物，TG1組與TG2組相比較無顯著差異，說明芪柏愈瘍油與復(fù)方紫草油作用相仿，療效確切。)

3 討論

CD31是在內(nèi)皮細(xì)胞上介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的整合素蛋白[6]，同時也是一種新型的微血管標(biāo)記物，能夠特異性標(biāo)記新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，并參與血管生成過程[7,8]。但CD31在血小板、單核細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等細(xì)胞中少量表達(dá)。研究小鼠模型發(fā)現(xiàn)，CD31與細(xì)胞粘附功能有關(guān)，其胞內(nèi)域的磷酸化作用能夠調(diào)控細(xì)胞連接和細(xì)胞遷移，將CD31某些胞內(nèi)域的表達(dá)敲除后，則會切斷小鼠成纖維細(xì)胞間的信息連接[9]。CD31含有SHP-2停泊的特異位點(diǎn)，CD31胞內(nèi)域的酪氨酸殘基磷酸化，與SHP-2結(jié)合，可啟動MAPK/ERK等信號通路，通過調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等一系列活動，促進(jìn)血管生成。

本次研究結(jié)果顯示藥物干預(yù)后7、14天，與模型組(MG組)相比，芪柏愈瘍油組(TG1組)與復(fù)方紫草油組(TG2組)大鼠創(chuàng)面組織中CD31的表達(dá)均明顯增加，且TG1組和TG2組作用未見明顯差異，復(fù)方紫草油是目前臨床上公認(rèn)治療糖尿病創(chuàng)面愈合的有效藥物，能夠有效促進(jìn)創(chuàng)面血管新生，從而達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果。此次研究中芪柏愈瘍油對創(chuàng)面組織中CD31的表達(dá)影響與復(fù)方紫草油無明顯差異，說明芪柏愈瘍油能夠通過提高大鼠創(chuàng)面組織中CD31的表達(dá)水平，有效促進(jìn)創(chuàng)面血管新生，達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。