盛芳，胡幫燕，金強(qiáng)，吳翠云，羅正榮*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070；2.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院)

核桃(JuglansregiaL.)是胡桃科(Juglandaceae)核桃屬(JuglansL.)落葉喬木或灌木，大多分布于北半球。中國現(xiàn)有核桃屬植物9種，其中以核桃和泡核桃(J.sigillataDode)最為常見。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，2017年中國核桃栽培面積48.99萬hm2(占世界44.6%)、年產(chǎn)量192.54萬t(占世界50.3%)，均居世界第一。

植物多酚(Polyphenols)是以苯酚為基本骨架的多羥基酚類次生代謝產(chǎn)物的總稱。核桃多酚類物質(zhì)主要包括酚酸類、黃酮類、單寧類，其中鞣花單寧是最重要的酚類化合物，還含有沒食子酸、鞣花酸、咖啡酸、兒茶素、香豆酸等，在其青皮、內(nèi)果皮、種皮、種仁中均有分布，不同部位的多酚種類和含量有明顯差異。核桃青皮主要含胡桃醌、山奈酚、槲皮素等；核桃葉片內(nèi)主要含槲皮素和新綠原酸[1]；核桃種仁種皮中主要成分為綠原酸、丁香酸、鞣花酸等[2]。

核桃多酚具有抗氧化活性，不僅防止種仁氧化，對人體也有抗氧化作用，可延緩衰老[3]?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)與藥理學(xué)研究表明，核桃多酚在健腦益智[4,5]、降低血脂[6]和血糖等方面功效明顯[7]。核桃多酚提取物具一定的抗癌[8,9]、殺蟲和抑菌作用[10]；對酪氨酸酶活性有抑制作用[11,12]。以核桃青皮為原料可制備染發(fā)劑[13]。

核桃酚類物質(zhì)鑒定及其生物合成途徑等研究具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。筆者從植物多酚的種類及特點(diǎn)出發(fā)，就核桃多酚的化學(xué)組成、定性定量分析和生物合成途徑等方面進(jìn)行綜述。

1 核桃多酚的種類及其特點(diǎn)

植物多酚主要包括酚酸類、單寧類、黃酮類等?？扇苄远喾又饕植加谥参锛?xì)胞的液泡內(nèi)，不溶性多酚則是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的組分。核桃中只有少部分酚酸以游離態(tài)存在，多數(shù)是與纖維素、蛋白、木質(zhì)素、類黃酮、葡萄糖等結(jié)合的形式存在。單寧多元酚是植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物之一[14]，能與生物堿、蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)以及金屬離子發(fā)生沉淀反應(yīng)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同可分為水解單寧和縮合單寧；王全杰等[15]通過試驗(yàn)證實(shí)核桃青皮中單寧屬水解類單寧。黃酮醇是植物中常見的黃酮類物質(zhì)，是主要的核桃酚類成分，具有清除自由基和抗炎活性，預(yù)防胰島素受阻、心血管疾病及消除肥胖的能力(表1)。

表1 核桃多酚的種類和成分

2 核桃多酚的分析技術(shù)

2.1 提取和分離純化

核桃多酚化合物常與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)通過氨鍵和疏水鍵形成穩(wěn)定的復(fù)合物分子，提取多酚常用的提取液有水和有機(jī)溶劑。溶劑提取法常借助于超聲波、微波、離子液體等輔助提取技術(shù)以縮短提取時(shí)間和提升產(chǎn)量[21,22]。生物技術(shù)手段也是成分提取中較常用的方法之一，主要包括酶解法和微生物發(fā)酵法。酶解法具高度專一性、強(qiáng)催化活性和反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)。酶解法與超聲波或微波技術(shù)結(jié)合也可提高提取率[23,24]。超臨界萃取法具有萃取速度快、無污染、無化學(xué)殘留、可在室溫下提取分離的優(yōu)點(diǎn)，目前常用CO2做萃取劑[25]。Regueiro等[22]通過60%丙酮水渦旋1分鐘后在冰上超聲處理5分鐘，并結(jié)合LC-LTQ-Orbitrap技術(shù)綜合鑒定核桃中酚類化合物，根據(jù)其保留時(shí)間，測量的離子質(zhì)量碎片數(shù)據(jù)，初步鑒定了120種化合物，包括可水解和縮合的單寧，類黃酮和酚酸，并新鑒定了8種核桃多酚類物質(zhì)。

色譜技術(shù)常被用來分離和純化植物有效成分，主要有薄層色譜(TLC)、柱色譜(CC)、氣相色譜(GC)[26]和高效液相色譜(HPLC)[27,28]等。馬樂等[27]利用NKA-9樹脂分離純化核桃青皮多酚，對吸附條件和洗脫條件優(yōu)化后，經(jīng)HPLC鑒定和分析表明，核桃青皮酚類物質(zhì)主要由原兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁等單體組成，其中的表兒茶素、原兒茶素和蘆丁含量較高。

2.2 定性和定量

各光譜數(shù)據(jù)的相互印證是化學(xué)成分準(zhǔn)確鑒定的必備條件，對已分離純化的樣品可先用熔點(diǎn)、氣相色譜和高效液相色譜來證實(shí)樣品的純度[29,30]，然后利用紅外光譜確定官能團(tuán)的特征吸收[31]，利用質(zhì)譜的分子離子峰確定化合物的分子量和分子式[32,33]，利用核磁共振譜分析組成分子的碳?xì)涔羌苄畔32]。Liu等[32]通過UHPLC-Q Orbitrap HRMS鑒定了核桃隔膜中200種化合物，包括可水解的單寧，類黃酮，酚酸和醌，其中超過150種首次在隔膜中獲得鑒定；使用UHPLC-MS/MS成功定量了21種具有健康促進(jìn)作用的膳食多酚，總含量為2.88～6.18mg/g；表征和定量了隔膜中具生物活性的化合物。Shi等[30]對不同發(fā)育階段的核桃青皮中酚類含量和抗氧化活性進(jìn)行分析，4月底至6月初總酚和總黃酮含量下降，此后增加，至8月初再次下降。用HPLC技術(shù)分析了13種酚類化合物含量，隨季節(jié)變化，不同酚類化合物的變化趨勢不同，其中胡桃醌含量最高；總酚和總黃酮含量與抗氧化活性密切相關(guān)，但單個(gè)酚類化合物和抗氧化活性之間的相關(guān)性不太顯著(具體分析技術(shù)見表2)。

表2 核桃多酚的分析技術(shù)

3 核桃多酚的生物合成途徑及相關(guān)基因

核桃中存在豐富多樣的酚類物質(zhì)，以水解單寧(Hydrolyzed tannins,HTs)為主，但核桃單寧的生物合成機(jī)制尚不完全清楚[34]。根據(jù)已有研究，部分水解單寧由莽草酸途徑合成，Muir等[35]研究中強(qiáng)調(diào)沒食子酸(Gallic acid,GA)的羧基來自莽草酸(Shikimic acid,SA)途徑的中間體，沒食子酸(GA)是許多植物次生代謝產(chǎn)物的必需前體，特別是沒食子單寧和鞣花單寧。Ossipov等[36]研究白樺發(fā)現(xiàn)，莽草酸代謝存在質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)兩種途徑，脫氫莽草酸的生物合成可能是從細(xì)胞質(zhì)中的莽草酸途徑的上游區(qū)段中的脫氫奎寧酸進(jìn)行的，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為水解單寧，即水解單寧來自莽草酸途徑的中間化合物脫氫莽草酸。Muir等[35]將核桃的莽草酸脫氫酶(Shikimate dehydrogenase,SDH)基因過表達(dá)到煙草中，顯示GA積累增加；通過純化核桃SDH在大腸桿菌中過表達(dá)，并采用反相液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(RP-LC/ESI-MS)聯(lián)用技術(shù)定量和驗(yàn)證GA的生成；研究證明SDH是一種對芳香族氨基酸合成必不可少的莽草酸途徑酶，也是GA生產(chǎn)所必需的；GA合成由雙功能酶SDH催化。

Xu等[37]首次分離并表征了來自核桃的PAL基因，分析了其在不同組織和脅迫下的表達(dá)譜，預(yù)測JrPAL可能是一種應(yīng)激反應(yīng)基因。Christopoulos和Tsantili[38]研究發(fā)現(xiàn)冷應(yīng)激下PAL的特異性和總活性增加；酚類中2，4-二羥基苯甲酸和原兒茶酸乙酯、4-羥基苯甲酸、2，4-二羥基苯甲酸、丁香酸和香草酸的增加與PAL活性增加一致，而鞣花單寧則基本上不依賴于PAL，原兒茶酸的增加和原兒茶酸乙酯的減少與PAL沒有直接關(guān)系。Cheniany和Ganjeali[39]通過RT-PCR技術(shù)探究核桃體外生根過程中PAL和C4H基因的發(fā)育表達(dá)模式，以及與槲皮素含量變化之間的關(guān)系，研究結(jié)果表明，PAL基因表達(dá)與槲皮素的變化呈正相關(guān)，C4H與核桃根莖的酚類化合物形成無關(guān)。可見苯丙烷類代謝途徑與酚酸生物合成直接相關(guān)(圖1)。

4 小結(jié)

目前核桃多酚的研究主要集中在定性、定量和生物活性，少數(shù)涉及生物合成途徑。結(jié)合多種光譜分析方法確定核桃多酚以種類豐富、含量各異的多種酚酸和類黃酮的單體為主要組成成分；以水解單寧為主的核桃多酚的合成除莽草酸途徑和苯丙烷類途徑中個(gè)別基因外，其合成機(jī)制并不完全清楚。進(jìn)一步的研究應(yīng)在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上著重核桃多酚代謝路徑、成分細(xì)化和產(chǎn)品開發(fā)研究，從而促進(jìn)核桃附加值的提高和核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。