蘇晨，毛永盡，楊慧琳，曲波，趙鋒，崔英俊

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

0 引 言

乳腺發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能會(huì)隨機(jī)體發(fā)育在細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）精細(xì)調(diào)控下而周期性重塑[1]。乳腺的發(fā)育過程包括胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期和退化期。乳腺發(fā)育開始于胚胎期，青春期完成導(dǎo)管的分化和延伸，妊娠期形成分泌性腺泡，泌乳早期乳腺實(shí)質(zhì)與乳腺上皮細(xì)胞持續(xù)增殖，最后退化期乳腺退化，細(xì)胞凋亡，腺泡導(dǎo)管塌陷，乳腺恢復(fù)成簡(jiǎn)單導(dǎo)管結(jié)構(gòu)[2-3]。腺體經(jīng)歷重塑恢復(fù)至妊娠前的狀態(tài)，完成一個(gè)周期，從而影響奶牛泌乳。基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMP）是基質(zhì)上皮界面上主要的細(xì)胞外蛋白酶，其中基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix Metalloproteinases 9，MMP9）被認(rèn)為是乳腺周期性重塑的關(guān)鍵酶[4]。MMP9（明膠酶-b）是一種IV型膠原酶[4]，可由乳腺上皮細(xì)胞，基質(zhì)成纖維細(xì)胞和浸潤(rùn)的免疫/炎癥細(xì)胞表達(dá)[5-7]。MMP9在形態(tài)發(fā)生、傷口愈合[8]、組織修復(fù)和重塑、細(xì)胞生長(zhǎng)、炎癥反應(yīng)[1,9]、腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成[10-13]等生理過程中發(fā)揮重要作用。核因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，可調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子，趨化因子，黏附分子和凋亡抑制劑的表達(dá)[14-15]。在受到外界刺激時(shí)，NF-κB兩個(gè)亞基（P65或P50）活化，從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞核，并與NF-κB反應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)相結(jié)合，從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄[16]。已有研究表明，在人乳腺癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞中MMP9表達(dá)受NF-κB信號(hào)通路調(diào)控[17-18]。但在牛乳腺上皮細(xì)胞中MMP9表達(dá)是否也受NF-κB信號(hào)通路調(diào)控還需確認(rèn)。本研究旨在確認(rèn)牛MM P9啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的相互作用，為改善奶牛牛奶品質(zhì)提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)室保存的牛乳腺上皮細(xì)胞和Hela細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)室保存的p RL-TK、pGL3-Basic、p GL3-CMV和P65過表達(dá)質(zhì)粒；胎牛血清，BI；DMEM-F12培養(yǎng)液，Gibco；lipofectamineTM2000，Thermo Scientific；Kpn I和Bgl II限制性內(nèi)切酶，Takara；T 4連接酶，Takara；Celastrol、RIPA裂解液，索萊寶；Dual-Luciferase Reporter Assay System，Promega；Endo-free Plasmid MiniKit II，Omega；SDS-PAGE配膠試劑盒，碧云天；VE-108B垂直電泳槽，Tanon；VE 186轉(zhuǎn)移電泳槽，Tanon；EPS300電泳儀，Tanon；Sag Capture，天能；Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，Promega。

1.2 研究方法

1.2.1 牛MMP9啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

從奶牛乳腺組織中提取DNA，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找牛MMP9基因啟動(dòng)子序列。使用JASPAR、hTFtarget數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子P65（NF-κB的一個(gè)亞基）與MMP9啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物，如表1所示，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得4條逐級(jí)縮短的啟動(dòng)子片段。PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳回收并純化，與p GL3載體質(zhì)粒分別使用Kpn I和Bgl II進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化并測(cè)序。測(cè)序成功后的MMP9啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒備用。

表1 MMP9啟動(dòng)子區(qū)引物序列

1.2.2 P65過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染

將牛乳腺上皮細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%密度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)分為對(duì)照組、過表達(dá)陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）空載體）和P65過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染P65過表達(dá)載體）三組。用lipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作參照說明書。轉(zhuǎn)染48 h后收取樣品。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

轉(zhuǎn)染48 h后，用RIPA裂解液收取1.2.2中各處理組的細(xì)胞總蛋白，具體操作參照說明書。按SDS-PAGE配膠試劑盒說明書配制10%的膠電泳，并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜上，時(shí)間為90 min。掃描蛋白條帶，用ImageJ軟件分析灰度值。

1.2.4 雙熒光素酶活性檢測(cè)

將Hela細(xì)胞接種至24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%密度時(shí)，每孔轉(zhuǎn)染0.5μg空載體或P65過表達(dá)載體，與此同時(shí)分別將構(gòu)建成功的4個(gè)MMP9啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體質(zhì)粒0.5μg或p GL3-Basic質(zhì)粒和0.01μg p RL-TK質(zhì)粒（用50μL Opti-MEM稀釋）共轉(zhuǎn)染進(jìn)Hela細(xì)胞，使用2.0μL LipofectamineTM2 000試劑（用50μL Opti-MEM稀釋）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后測(cè)定雙熒光素酶活性。NF-κB抑制實(shí)驗(yàn)是在0.5μg P65過表達(dá)質(zhì)粒，0.5μg啟動(dòng)子質(zhì)粒及0.01μg p RL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞6 h后，添加NF-κB抑制劑Celastrol作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)置不添加抑制劑的對(duì)照組。各組均在轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光活性，通過計(jì)算其比值確定MMP9基因核心啟動(dòng)子片段。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS26.0和GraphPad Prism8.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t-檢驗(yàn)和方差分析并作圖。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。數(shù)據(jù)標(biāo)記字母相同為差異不顯著，字母不同為差異顯著?！?”代表P＜0.05，表示差異顯著；“**”代表P＜0.01，表示差異極顯著；P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 MMP9啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

利用PCR技術(shù)從牛乳腺DNA中擴(kuò)增獲得4個(gè)不同長(zhǎng)度的MMP9啟動(dòng)子片段，并連接至p GL3-Basic雙熒光素報(bào)告載體中，構(gòu)建4個(gè)啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體，分別命名為MMP9-640、MMP9-420、MMP9-380、MMP9-80。用Kpn I和Bgl II對(duì)構(gòu)建的雙熒光素酶載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，凝膠電泳預(yù)期位置出現(xiàn)條帶，如圖1所示。說明MMP9-640、MMP9-420、MMP9-380、MMP9-80雙熒光素酶載體構(gòu)建成功。

圖1 MMP9啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體雙酶切結(jié)果

2.2 P65過表達(dá)對(duì)MM P9蛋白表達(dá)的影響

P65過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞48 h后，用Western blotting法檢測(cè)p-P65、P65及MMP9蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，P65過表達(dá)組的p-P65、P65、MMP9的蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和過表達(dá)陰性對(duì)照組（P＜0.05），如圖2所示，說明P65過表達(dá)能促進(jìn)MMP9蛋白表達(dá)。

圖2 P65過表達(dá)后對(duì)牛乳腺上皮細(xì)胞p-P65、P65、MMP9表達(dá)的影響

2.3 牛MMP9啟動(dòng)子活性分析

在轉(zhuǎn)染空載體或P65過表達(dá)載體的同時(shí)，將MMP9啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體質(zhì)?；騪 GL3-Basic質(zhì)粒和p RL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)Hela細(xì)胞，24 h后測(cè)定雙熒光素酶活性。結(jié)果表明P65過表達(dá)組比過表達(dá)陰性對(duì)照組的雙熒光素酶活性顯著提高（P<0.05），且MMP9-640、MMP9-420和MMP9-380這3個(gè)啟動(dòng)子片段的活性與p GL3-Basic陰性對(duì)照組相比較均差異極顯著（P<0.01），如圖3所示。通過比較不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段的活性值，發(fā)現(xiàn)MMP9-420的活性值最高，其次分別是MMP9-380和MMP9-640。且MMP9-420與MMP9-380雙熒光素酶活性之間沒有顯著性差異（P＞0.05），說明-420～-80bp區(qū)域是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。

圖3 MMP9基因啟動(dòng)子區(qū)不同長(zhǎng)度片段的熒光活性

2.4 NF-κB抑制劑對(duì)MMP9轉(zhuǎn)錄活性的影響

在轉(zhuǎn)染P65過表達(dá)載體的同時(shí)，將MMP9-420啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體質(zhì)粒和p RL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后分為兩組，一組添加Celastrol，另一組不添加設(shè)為對(duì)照，轉(zhuǎn)染24 h后測(cè)定雙熒光素酶活性。結(jié)果表明，Celastrol組雙熒光素酶活性值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，如圖4所示。

圖4 NF-κB抑制劑對(duì)MMP9轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)

3 結(jié) 論

NF-κB是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，可與多種基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)[16]。黃等[19]研究發(fā)現(xiàn)在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中NF-κB能促進(jìn)乳合成和乳腺上皮細(xì)胞增殖。已有研究表明在人結(jié)腸癌細(xì)胞和鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路能正向調(diào)控MMP9表達(dá)[20-22]。但在牛乳腺上皮細(xì)胞中MMP9表達(dá)是否受NF-κB信號(hào)通路調(diào)控未見報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在牛乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)NF-κB的亞基P65后，可以促進(jìn)MMP9蛋白表達(dá)，表明在牛乳腺上皮細(xì)胞中MMP9的表達(dá)可受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。MMP9是MMP家族最復(fù)雜的形式之一，可降解ECM[23]，參與乳腺重塑[24]，使乳腺發(fā)育逐步積累，提高奶牛乳產(chǎn)量。MMP9還可促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖[25-26]，抑制山羊乳腺上皮細(xì)胞凋亡[27]。為進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與MMP9啟動(dòng)子的具體結(jié)合區(qū)域，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建4個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體，通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)分析各啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)錄活性，得出MMP9啟動(dòng)子-420～-80 bp區(qū)域是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。在添加NF-κB抑制劑Celastrol后，啟動(dòng)子活性顯著降低，進(jìn)一步說明轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可直接靶向奶牛MMP9基因啟動(dòng)子區(qū)域并促進(jìn)MMP9基因表達(dá)。這一結(jié)論為我國(guó)目前奶業(yè)發(fā)展中面臨的困境提供新的解決方法及思路，具有重要的生產(chǎn)實(shí)際意義。