首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室 （北京 100069）

內(nèi)容提要：目的：利用BD FACSAria Ⅲ流式細(xì)胞儀，通過兩次分選獲得高純度的GFP陽(yáng)性HEK293T細(xì)胞。方法：GFP-px458空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀yield結(jié)合purity模式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行兩次分選，比較二次分選后陽(yáng)性細(xì)胞的純化率與細(xì)胞分別經(jīng)yield 和purity單次分選的差異并對(duì)分選后細(xì)胞進(jìn)行7-AAD染色鑒定分選后細(xì)胞的活性。結(jié)論：使用BD FACSAria Ⅲ型流式細(xì)胞儀的yield加purity模式可將低表達(dá)量3.1±1.0%且分群不明顯的GFP+293T純化至96.5±1.1%，且活性良好，是一種可靠的獲取高純度目的細(xì)胞的方法。

免疫磁珠法和流式細(xì)胞分選法是目前純化活細(xì)胞最常用的兩種技術(shù)，其中，流式細(xì)胞分選技術(shù)因其高通量，多參數(shù)多熒光，且能實(shí)現(xiàn)四路同時(shí)分選而有更為廣泛的應(yīng)用[1]。快速獲取足夠數(shù)量的高純度活細(xì)胞是目前對(duì)分選實(shí)驗(yàn)的基本要求。BD FACSAria Ⅲ是目前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用比較廣泛的流式細(xì)胞儀，該儀器特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，能夠利用Accurdrop beads快速準(zhǔn)確調(diào)節(jié)分液滴延遲，且存在sweet spot分選液流監(jiān)控系統(tǒng)保證液流斷點(diǎn)穩(wěn)定。目前，利用流式細(xì)胞儀分選獨(dú)立群體CD4，CD8陽(yáng)性細(xì)胞效果優(yōu)于免疫磁珠分選，分選后細(xì)胞回測(cè)，目的細(xì)胞能達(dá)到90%以上，但對(duì)于分選低表達(dá)，目的細(xì)胞陽(yáng)性率在0%～5%，且陽(yáng)性細(xì)胞熒光分布彌散的樣品，往往存在純化率不高，分選時(shí)間過長(zhǎng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞活性差等問題[2,3]。FACSAria Ⅲ根據(jù)收集原理不同設(shè)置有purity（純化）、4 way purity（四路純化）、yield（富集）和single cell（單細(xì)胞）四種分選模式可選，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇分選模式從而得到不同純度的細(xì)胞。本文以攜帶GFP報(bào)告基因的PX458空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞為例，利用流式細(xì)胞儀上yield分選模式與purity分選模式相結(jié)合，縮短分選時(shí)間，提高目的細(xì)胞分選陽(yáng)性率，獲得純度及數(shù)量更高的目的細(xì)胞。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

攜帶GFP報(bào)告基因的PX458空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，由首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供，Accudrop beads，CST beads購(gòu)自BD公司，7-AAD試劑購(gòu)自Biolegend公司，分選使用儀器為BD FACSAria Ⅲ，美國(guó)BD公司產(chǎn)品，分選用鞘液為PBS緩沖液，配制后以0.22μm濾膜過濾并高壓滅菌，冷卻后使用。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀分選前液流參數(shù)的調(diào)節(jié)

打開FACSDiva軟件并運(yùn)行開機(jī)程序，安裝85μm噴嘴打開分選液流Stream，參數(shù)的調(diào)節(jié)主要涉及主液流液滴斷點(diǎn)的調(diào)節(jié)和液滴延遲的調(diào)節(jié)。首先根據(jù)儀器說明書指導(dǎo)，使用85μm噴嘴時(shí)液滴頻率Freq設(shè)定為47，上下調(diào)節(jié)液滴振幅Ampl以確定適合的Gap值，輸入能夠讓液滴斷點(diǎn)穩(wěn)定的Drop1值和Gap值，而后選中主液流框的sweet spot鍵，儀器會(huì)自動(dòng)確定液滴頻率使液流穩(wěn)定。上樣CST質(zhì)控微球運(yùn)行CST程序以檢測(cè)儀器光路狀態(tài)穩(wěn)定，待液流光路均為穩(wěn)定狀態(tài)后調(diào)節(jié)分選液滴延遲。上樣Accudrop beads微球，調(diào)節(jié)上樣速度為800～2000evt/s，打開分選電壓和濾光片圖標(biāo)（Optical Filter），選中Auto Delay鍵，系統(tǒng)自動(dòng)調(diào)節(jié)液滴延遲數(shù)值，使得微球在initial或fine tune模式下都達(dá)到側(cè)液流偏轉(zhuǎn)以99%以上。

1.2.2 流式細(xì)胞分選

GFP+的HEK293T：以未轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞為對(duì)照設(shè)門確定GFP+細(xì)胞的位置；調(diào)節(jié)上樣速度4500～5500evt/s，將細(xì)胞分成3份，分別采取yield模式，purity的模式，yield分選后將細(xì)胞離心去除部分PBS上清并重懸，細(xì)胞再次purity模式分選。

1.2.3 分選效率檢測(cè)以及分選后細(xì)胞活力檢測(cè)

3種模式最終分選后的GFP+HEK293T細(xì)胞各自分成2份，一份再次上機(jī)進(jìn)行分選后純度檢測(cè)，另外一份離心后去上清PBS重懸至體積300μL后加入1μL 7AAD上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選后細(xì)胞死活情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀液流斷點(diǎn)及液滴延遲

使用85μm噴嘴進(jìn)行分選，頻率設(shè)定為47，第一滴液流斷點(diǎn)位置Drop1為275，Gap為8，此時(shí)開啟“sweet spot”自動(dòng)分選模式，振幅自動(dòng)調(diào)節(jié)在24.6的位置（圖1），上樣Accudrop beads后調(diào)節(jié)Drop Delay值為29.17，此時(shí)在initial和fine tune兩種模式下側(cè)液流偏轉(zhuǎn)均可達(dá)99%以上（圖2），液流開啟0.5h以上無晃動(dòng)，無斷點(diǎn)位置改變，說明穩(wěn)定性良好，各種參數(shù)符合分選條件。

2.2 GFP+HEK293T細(xì)胞分選模式與純度

分選前GFP+細(xì)胞百分比為3.1±1.0%，將細(xì)胞分為三組分別采用yield，purity，yield分選后再次purity模式進(jìn)行分選，分選后細(xì)胞進(jìn)行回測(cè)，GFP+細(xì)胞得率依次為yield+purity模式，purity模式，yield模式，陽(yáng)性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.5），結(jié)果見圖3，表1。三種模式分選后所得細(xì)胞經(jīng)7AAD染色，活細(xì)胞百分比無顯著差異（P＞0.5），見圖4。

圖1.調(diào)節(jié)后穩(wěn)定的液流斷點(diǎn)狀態(tài)

圖2.液滴延遲調(diào)節(jié)結(jié)果

圖3.GFP+細(xì)胞純度檢測(cè)

圖4.細(xì)胞活性檢測(cè)

表1.不同模式下分選前后GFP陽(yáng)性率和細(xì)胞活性(7-AAD染色)(每組n=3,±s,%)

表1.不同模式下分選前后GFP陽(yáng)性率和細(xì)胞活性(7-AAD染色)(每組n=3,±s,%)

注：與分選前比較，aP＜0.5，與上一組比較，bP＜0.5。

分選前 Yield模式 Purity模式 Yield+purity模式GFP陽(yáng)性率 3.1±1.0 86.2±0.8a 92.0±1.4ab 96.5±0.6abimages/BZ_25_1252_1593_2267_1645.png

3.討論

使用流式細(xì)胞儀分選，其分選后純度和活性會(huì)受多方面的影響。第一，儀器自身狀態(tài)：包括液流的穩(wěn)定性，液滴延遲時(shí)間的確定，激光信號(hào)的校準(zhǔn)[4]。穩(wěn)定的液流是準(zhǔn)確分選首要條件。開啟液流窗口的“sweet sopt”自動(dòng)監(jiān)控功能按鈕有助于維持分選液流穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)實(shí)際Gap值大于設(shè)定值±2時(shí)即液流穩(wěn)定性變差時(shí)分選會(huì)自動(dòng)停止。液滴延遲是用來設(shè)置細(xì)胞檢測(cè)點(diǎn)與斷點(diǎn)之間的時(shí)間間隔，精確的液滴延遲是通過分選Accudrop Beads的效果校正得到。此外，樣品分選前儀器需運(yùn)行CST程序檢測(cè)儀器激光強(qiáng)度及變異系數(shù)才CV是否在正常范圍內(nèi)[5]。

第二，分選模式的選擇。BD FACSAria Ⅲ屬于電荷分選型流式細(xì)胞儀，細(xì)胞通過檢測(cè)區(qū)域后會(huì)被高頻率的振蕩斷裂成均勻的小液滴，包裹有目標(biāo)細(xì)胞的液滴會(huì)被加相應(yīng)的電荷，樣品上機(jī)后，分選模式的選擇直接決定著哪部分細(xì)胞被看作目的細(xì)胞而后加電壓打入收集管。BD FACSAria Ⅲ提供了yield，purity，4-way purity，single cell四種分選模式，其中yield模式得率最高，分選速度最快，但純度欠佳，為了保證純度往往選擇purity模式，四路同時(shí)分選式選擇4-way purity，single模式一般單克隆細(xì)胞分選，此模式得到的細(xì)胞為單個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞，含有兩個(gè)或多個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的液滴被拋棄，因此率最低。本實(shí)驗(yàn)采取yield加purity的模式和模式進(jìn)行二次分選，首先將表達(dá)量低的陽(yáng)性細(xì)胞利用yield模式進(jìn)行富集，在能夠保證effiency為100%的情況下采取盡量快的速度上樣，這樣能夠?qū)㈥?yáng)性細(xì)胞迅速富集變成優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，使得GFP陽(yáng)性細(xì)胞86.2%±0.8%，收集后的細(xì)胞1000轉(zhuǎn)5min稍離心，吸除部分上層PBS后再次利用purity模式分選，調(diào)節(jié)上樣速度，使得effiency在90%左右，最終將所分細(xì)胞陽(yáng)性率純化至96.5±0.6%。

在細(xì)胞分選過程中，縮短分選時(shí)間也是需要考慮的問題之一。先富集，再分選，有助于縮短分選時(shí)間提高分選陽(yáng)性率。預(yù)富集的方式常用的有如下幾種：流式細(xì)胞儀的enrich模式，適用于熒光表達(dá)量低且細(xì)胞能夠抗液流壓力的樣本；免疫磁珠陰選法對(duì)于多色標(biāo)記淋巴細(xì)胞富集效果良好[6]；對(duì)于外周血來源的樣本，淋巴細(xì)胞分離液結(jié)合密度梯度離心法能夠?qū)α馨秃蛦魏思?xì)胞起到富集作用[7,8]。

由于FACSAria Ⅲ屬于液流電壓分選型流式細(xì)胞儀，因此分選過程中細(xì)胞一定會(huì)受到儀器液流系統(tǒng)壓力的影響，過大的壓力會(huì)造成細(xì)胞破碎或是死亡，分選過程中需根據(jù)細(xì)胞大小不同選擇不同噴嘴，噴嘴過小影響大細(xì)胞通過，且細(xì)胞承壓過大，而噴嘴過大則不能將細(xì)胞有效地在噴嘴位置排隊(duì)成單細(xì)胞，從而影響分選精度，本實(shí)驗(yàn)采取85μm噴嘴分選GFP+的HEK293T，分選后利用7-AAD染色檢測(cè)細(xì)胞活性，兩次分選與分選前無顯著性差異，說明目前儀器噴嘴和壓力條件適用于該細(xì)胞的分選，但是對(duì)于不同形態(tài)大小的細(xì)胞，使用的噴嘴規(guī)格尚需要摸索。除此之外，每次細(xì)胞分選時(shí)會(huì)利用儀器檢測(cè)系統(tǒng)的FSC閾值切除細(xì)胞碎片，F(xiàn)SC-A和FSC-H排出黏連細(xì)胞，也會(huì)主觀排除碎片或黏連體，有利于最終分選到的細(xì)胞是單一的，狀態(tài)良好的細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)利用FACSAria Ⅲ流式細(xì)胞儀的yield結(jié)合purtity兩種分選模式相結(jié)合，對(duì)GFP+的HEK293T進(jìn)行兩次分選，使得最終獲得的陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到了96.5%±0.6%，較單一模式分選法有所提高，分選的時(shí)間縮短，且分選后的細(xì)胞活性良好，是一種可靠的，獲取高純度陽(yáng)性細(xì)胞的方法。