嚴(yán)成其，趙碩，呂嘉城，王穎，陳磊，黃迪，譚曉菁，王栩鳴，周潔，楊勇，魯宇文，黃堅(jiān)，王芳，王俊敏，張志祥*

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040； 2.寧波惠貞書院，浙江 寧波 315030； 3.寧波五鄉(xiāng)中學(xué)，浙江 寧波 315010；4. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害性質(zhì)因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

疣粒野生稻(Oryzameyeriana)是我國現(xiàn)存的3種野生稻之一，經(jīng)鑒定對白葉枯的抗性達(dá)到高抗，接近免疫，其抗性持久穩(wěn)定，是最為理想的抗病育種材料[1-2]。疣粒野生稻染色體組型為GG，而栽培稻染色體組型為AA，使用常規(guī)的有性繁殖難以打破其生殖隔離的障礙，是利用其優(yōu)異性狀的巨大難點(diǎn)[3]。為了充分利用疣粒野生稻資源，課題組通過采用疣粒野生稻和栽培稻體細(xì)胞雜交的方法獲得其體細(xì)胞雜交后代，從而實(shí)現(xiàn)疣粒野生稻遺傳物質(zhì)向栽培稻的定向轉(zhuǎn)移工作。該試驗(yàn)為挖掘具有自主產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn)抗病、優(yōu)質(zhì)抗逆等多項(xiàng)優(yōu)良品種的水稻資源奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

試驗(yàn)研究中由于缺少遺傳背景一致的疣粒野生稻體細(xì)胞雜交后代，難以進(jìn)行抗病蟲基因研究和新種質(zhì)的繁育研究。組培快繁技術(shù)因其增殖速度快，生產(chǎn)周期短，繁殖系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，可在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)遺傳性一致的疣粒野生稻體細(xì)胞雜交后代規(guī)模化生產(chǎn)[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料疣粒野生稻體細(xì)胞雜交后代Y73來源于寧波市農(nóng)科院生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 材料的收集與消毒

取疣粒野生稻體細(xì)胞雜交后代Y73種子，經(jīng)70%乙醇消毒30 s，在0.1%升汞中搖動消毒8 min，并用無菌水沖洗3～5次。

1.2.2 Y73愈傷組織的誘導(dǎo)和胚性細(xì)胞的形成

取消毒后的疣粒野生稻體細(xì)胞雜交后代Y73種子置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織生成。通常每隔20 d挑選胚性愈傷組織或質(zhì)量好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷和繼代培養(yǎng)基使用MS+2.4-D 0.5～3.5 mg·L-1+6-BA 0.01～2.00 mg·L-1，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，黑暗培養(yǎng)，適量增加糖、瓊脂的濃度和添加谷氨酰胺。部分非胚性愈傷組織能誘導(dǎo)胚性愈傷組織。

1.2.3 胚性細(xì)胞分化成綠苗

將誘導(dǎo)出的胚性細(xì)胞接種在MS+NAA 0.5～4.5 mg·L-1+6-BA 0.01～2.50 mg·L-1+KT 1.5～2.0 mg·L-1分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，光強(qiáng)2 000～3 000 lx、光照16 h·d-1。

1.2.4 小苗生根培養(yǎng)

將由胚性細(xì)胞分化成的小苗接種在1/2MS+IAA 0.01～0.03 mg·L-1生根培養(yǎng)基中，置于25 ℃、光照強(qiáng)度2 000 lx、光照時(shí)間16 h·d-1的環(huán)境中培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)植株生長情況，包括植株高度、葉片數(shù)、根數(shù)等。

1.2.5 煉苗及移栽

待綠苗在培養(yǎng)基中長至10 cm后，直接打開培養(yǎng)瓶蓋，加入少量純凈水，水量以高過培養(yǎng)基2 cm為宜，定時(shí)觀察續(xù)水，14 d后用溫水將綠苗充分洗凈，然后置于內(nèi)含1/2MS+IAA 0.01～0.03 mg·L-1水溶液的三角瓶中，14 d后移栽到苗床。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)和胚性細(xì)胞的形成

由表1可知，將疣粒野生稻體細(xì)胞雜交后代的種子接種到MS+2.4-D 0.5～3.5 mg·L-1+6-BA 0.01～2.00 mg·L-1誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，部分愈傷組織可在30 d左右被成功誘導(dǎo)，初次誘導(dǎo)出的愈傷組織有些是非胚性的。若在繼代培養(yǎng)基中提高糖和瓊脂的濃度，同時(shí)添加谷氨酰胺，能使部分愈傷組織轉(zhuǎn)變成小顆粒狀的、易碎的胚性愈傷組織。

表1 不同培養(yǎng)基對誘導(dǎo)愈傷組織和胚性細(xì)胞的影響

在同一培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月左右能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)可建成分散性好、色澤鮮黃、細(xì)胞質(zhì)濃、分裂能力旺盛的胚性細(xì)胞。其中，胚性細(xì)胞誘導(dǎo)成功率最優(yōu)的培養(yǎng)基配方是MS+2.4-D 1.5～2.5 mg·L-1+6-BA 0.1～1.0 mg·L-1，成功誘導(dǎo)率可達(dá)11.1%～14.2%。

2.2 不同培養(yǎng)基濃度對體細(xì)胞雜交后代胚性細(xì)胞再生成苗的影響

設(shè)10組含有不同濃度激素的MS培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基接30個(gè)胚性細(xì)胞，63 d后觀察結(jié)果。表2表明，MS+NAA 1.5～2.0 mg·L-1+6BA 0.10～0.30 mg·L-1+KT 1.5～2.0 mg·L-1均可誘導(dǎo)成苗，成苗率可達(dá)到28.6%～40.7%。

表2 不同培養(yǎng)基濃度對胚性細(xì)胞再生成苗的影響

2.3 綠苗生根培養(yǎng)

將再生的小苗接種在1/2MS+IAA 0.01～0.03 mg·L-1培養(yǎng)基中，都能長出莖、根、葉完整的水稻植株，30 d后生根率達(dá)到91%。

2.4 煉苗及移栽

由于組培苗在形態(tài)和生理結(jié)構(gòu)上與自然生長苗存在一定差異，為了適應(yīng)移栽后的自然環(huán)境，煉苗顯得尤為重要。植株煉苗過程將組培苗從異養(yǎng)逐步過渡到自養(yǎng)，由無菌環(huán)境變?yōu)橛芯h(huán)境，溫光條件也發(fā)生顯著變化。本研究表明，煉苗7 d后的10～15 cm再生小植株直接移栽在保持濕度的苗床中，1周后成活率達(dá)到90%。

3 小結(jié)與討論

水稻細(xì)胞的生長主要受大量元素、微量元素、激素、維生素、有機(jī)質(zhì)、滲透壓、穩(wěn)定劑等影響。植物激素是影響誘導(dǎo)水稻愈傷組織和胚性細(xì)胞愈傷組織最關(guān)鍵因素，2.4-D是誘導(dǎo)愈傷組織最重要的關(guān)鍵激素成分。隨著2.4-D濃度的升高，其愈傷組織生長加快，胚性減少。當(dāng)2.4-D>3.5 mg·L-1或<1.0 mg·L-1時(shí)，都不利于水稻體細(xì)胞雜交后代的愈傷組織和胚性細(xì)胞愈傷組織的形成；6-BA<1.0 mg·L-1有利于胚性細(xì)胞的生長。已建成的胚性細(xì)胞愈傷組織中，繼代時(shí)間過長其胚性減弱，表現(xiàn)為細(xì)胞團(tuán)周邊細(xì)胞變得粗糙，部分細(xì)胞團(tuán)開始解體，形成不規(guī)則顆粒狀突起，同時(shí)出現(xiàn)非胚性細(xì)胞愈傷組織[6]。愈傷組織的色澤、外表對再生頻率均有一定影響，一般花菜形態(tài)、淺白色澤、結(jié)構(gòu)緊密的胚性愈傷組織在合適的分化培養(yǎng)基中容易變綠，并長出綠芽。最初誘導(dǎo)出的愈傷組織，大多是非胚性的，若在繼代培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺400 mg·L-1，提高瓊脂和糖的濃度分別大于10和35 g·L-1，并能使愈傷組織轉(zhuǎn)變成易碎的小顆粒狀的胚性愈傷組織[7]。胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到合適量的含有細(xì)胞分離素和生長素的培養(yǎng)基中再生小苗，小苗在低濃度IAA減半基本培養(yǎng)基中長根。小植株在移栽之前必須經(jīng)過煉苗，與其他植物組織培養(yǎng)苗不同，水稻小苗可以直接移栽至水稻土壤。