劉 熔，王昌敏，郝立君，盧佩佩，李智偉

布魯菌病是全球最常見的人獸共患病之一[1]。布魯氏菌導致的感染如得不到及時診斷和規(guī)范治療常會導致慢性化，有時甚至是終身的。目前關于布魯菌病轉變?yōu)槁誀顟B(tài)的原因仍不明確。T細胞介導的細胞免疫在布魯氏菌感染中發(fā)揮關鍵作用[2]。Treg細胞是發(fā)揮免疫抑制的重要細胞，可以預防感染過程中的免疫病理損害和抵御過度活躍的免疫反應對宿主的傷害，F(xiàn)oxp3是Treg細胞的轉錄因子，IL-10是Treg 細胞分泌產生的一種重要的抗炎免疫抑制細胞因子[3]。本文通過流式細胞術，熒光定量PCR和Aimplex方法評估Treg細胞，F(xiàn)oxp3的mRNA表達及IL-10水平在布魯氏菌感染中的變化特點和相關性。為布魯菌病的免疫應答機制提供一定的理論依據，為布魯菌病的治療尋找新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2019年6-12月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院就診并明確診斷為布魯菌病的患者49例，其中急性期20例，慢性期29例，分別設立急性布病組和慢性布病組。納入標準：符合WS 269-2019《布魯菌病診斷》的標準，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、骨關節(jié)痛、全身乏力等，虎紅平板凝集試驗(RBPT)進行初篩陽性和試管凝集試驗(SAT)檢測血清中抗布魯氏菌特異性抗體，滴度≥1∶50者。同期募集52例健康體檢人群作為正常對照組，性別年齡與急、慢性布病組無統(tǒng)計學差異。3組人員均進行了虎紅平板試驗和試管凝集試驗，急、慢性布病組發(fā)熱時進行血培養(yǎng)檢測。3組人員均排除腫瘤、傷寒、風濕熱、結核、自身免疫病和其他各種感染等疾病的人員。所有人員均簽署知情同意書，本研究經過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，患者知情同意，批準號：KY201803742。

1.2儀器與試劑 美國BD FACS Canto plus流式細胞儀，美國Bio-Rad實時熒光定量PCR儀。美國BD的CD3 PerCP(552851，SP34-2)，CD4 FITC(550628，L200)，CD25 APC(555434，M-A251)，CD127 PE(561028，HIL-7R-M21)，溶血素(349202)。美國GE淋巴細胞分離液Ficoll-Paque密度梯度液(17-5442-02)，北京全式金TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(AT311)，凱捷T QuantiNava SYBR Green Kit(208054)，愛信 Trizol試劑(abs9331)。

1.3 方 法

1.3.1樣本處理 采集20例急性布魯菌病患者、29例慢性布魯菌病患者和52例正常對照組人群的全血標本，使用EDTA抗凝。分為3管，1管直接使用流式細胞儀檢測Treg細胞表型和數(shù)量；1管用淋巴細胞分離液Ficoll-Paque密度梯度液(美國GE)依照說明書操作步驟提取PBMC，加入TRLZOL凍入-80 ℃低溫冰箱保存，用于mRNA檢測；另1管3 000 r/min離心5 min吸取上清轉移至EP管，-80 ℃低溫冰箱保存，用于IL-10檢測。

1.3.2流式檢測 吸取全血樣本100 μL，分別加入CD3 PerCP 20 μL，CD4 FITC 20 μL，CD25 APC 5 μL，CD127 PE 20 μL。避光室溫放置15 min，加入2 mL溶血素10 min后離心去上清，加入2 mL PBS洗滌離心去上清，加入500 μL PBS，重懸。上BD FACS canto plus流式細胞儀檢測，使用FlowJo 10.0進行數(shù)據分析。

1.3.3熒光定量PCR檢測 使用qRT-PCR檢測Treg轉錄因子Foxp3的mRNA水平。將凍存的標本取出，依照說明書步驟反轉錄成cDNA。擴增體系條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)，結果用2-△△Ct相對定量法，分別對布魯菌病組與正常對照組中的目的基因進行定量。引物序列由上海生工合成，F(xiàn)oxP3 5′-FGTGGCCCGGATGTGAGAAG-3′；FoxP3 5′-RGGAG-CCCTTGTCGGATGATG-3′；β-Actin-F-5′：CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，β-Actin-R-5′-CT-CCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.3.4IL-10檢測 將凍存的EP管取出，依照Aimplex試劑盒說明書準備標準品和樣品，使用BD FACS canto plus流式細胞儀檢測熒光微球，保存流式細胞儀的FCS數(shù)據文件，并利用軟件FCAP Array 3.0進行數(shù)據結果分析。

2 結 果

2.1研究對象概況 本研究共納入急性布魯菌病患者20例，年齡26～62歲，平均年齡44.3±8.7歲，慢性布魯菌病患者29例，年齡22～71歲，平均年齡43.1±8.6歲。正常對照組52人，年齡25～72歲，平均年齡44.7±7.4歲。詳見表1。

表1 急慢性布病組與正常對照組的基本資料

2.2流式細胞術檢測Treg細胞 使用流式細胞術檢測CD3+CD4+CD25+CD127low的Treg細胞數(shù)量與表型。結果見圖1和表2，與正常對照組相比，急性布病組的Treg細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.87，P=0.01)；慢性布病組Treg細胞比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.82，P<0.01)。與急性布病組相比，慢性布病組Treg細胞比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.96，P<0.01)。

表2 Treg、Foxp3和IL-10水平

注：A為正常對照組；B為急性布病組；C為慢性布病組。

2.3熒光定量PCR檢測Foxp3 mRNA 使用qRT-PCR檢測PBMC的Foxp3 mRNA水平。結果顯示，與正常對照組相比，急性布病組的Foxp3 mRNA表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.42，P<0.01)；慢性布病組Foxp3 mRNA表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.89，P<0.01)。與急性布病組相比，慢性布病組Foxp3 mRNA表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.38，P=0.02)，如圖2和表2所示。

注：A Treg比例，B為Foxp3 mRNA相對表達水平，B為IL-10水平。 與正常對組相比：②P<0.05，③P<0.01；與急性布病組相比：⑤P<0.05，⑥P<0.01。

2.4IL-10水平檢測結果 本研究使用Aimplex法檢測外周血漿中的IL-10水平。結果表明，與正常對照組相比，急性布病組的IL-10水平增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.90，P<0.01)；慢性布病組IL-10水平增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=21.42，P<0.01)。與急性布病組相比，慢性布病組IL-10水平增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.64，P<0.01)，如圖2和表2所示。

2.5Treg細胞與Foxp3 mRNA，IL-10的相關性 分析布魯菌病患者的Treg數(shù)量與Foxp3 mRNA表達水平的相關性以及Treg數(shù)量與IL-10表達水平的相關性。結果表明，F(xiàn)oxp3 mRNA和Treg數(shù)量呈正相關(R=0.72，P<0.01)，IL-10水平與Treg數(shù)量呈正相關(R=0.71，P<0.01)，如圖3。

注：A為Foxp3與Treg相關性分析，B為IL-10與Treg相關性分析

3 討 論

布魯菌病慢性患者較多[4]，免疫機制不清，給患者身體健康帶來極大危害。布魯氏菌作為胞內寄生菌，T淋巴細胞主導的細胞免疫在抵御布魯氏菌感染中發(fā)揮關鍵作用[5]。宿主無法抵御布魯氏菌長期感染的原因可能是由于適應性免疫反應減弱而導致。CD4+T細胞參與了適應性免疫應答的調節(jié)[6]，可以通過分化成不同的亞型調節(jié)宿主的免疫應答，Treg細胞是一種具有免疫抑制活性的CD4+T細胞亞群，對于各種病理和生理學免疫應答的負調控至關重要。Treg細胞除了可抑制外部或自身抗原的過度免疫反應，還可防止多種自身免疫性疾病[7]，最重要的是Treg細胞也與病原體感染和癌癥相關的過度免疫反應的負向控制有關，在某些情況下可能對宿主有害，導致慢性感染[8]。布魯氏菌慢性化程度較高的原因可能與Treg細胞數(shù)量增多有關[9]。本研究結果顯示，在布魯菌病患者的Treg細胞數(shù)量升高，慢性布病患者升高更為顯著，Hasanjani等[10]也發(fā)現(xiàn)Treg細胞在布魯菌病患者中顯著增多的現(xiàn)象，動物實驗發(fā)現(xiàn)在布魯氏菌持續(xù)感染中Tregs細胞保持其抑制功能[11]。因此，研究結果表明Treg細胞參與了布魯菌病的發(fā)生和發(fā)展。由于Treg細胞的增多可以有效抑制炎癥反應，Treg細胞可以增加免疫細胞上的抑制性表面分子如B7的表達，并下調抗原提呈細胞功能，競爭性抑制APC細胞上的協(xié)同共刺激分子活化。Treg還能抑制NK細胞的增殖、細胞因子分泌和細胞毒作用[12]。Treg細胞上表達的CD25是IL-2的受體，可以有效抑制IL-2的生物學功能，而IL-2可以促進Th1細胞和NK細胞增殖活化[13]。因此，Treg細胞的這些生物學功能可能是導致布魯氏菌持續(xù)感染的原因。

Foxp3是Treg細胞的轉錄因子，對于Treg細胞的發(fā)育和功能控制發(fā)揮關鍵作用[14]，該轉錄因子已被認為是Treg細胞發(fā)育和功能的主開關或調節(jié)器。本研究結果發(fā)現(xiàn)Foxp3的mRNA水平在布魯菌病患者特別是慢性患者中明顯高于正常對照組，說明Foxp3在布魯氏菌感染后出現(xiàn)上調，而Foxp3表達的高低變化代表了Treg細胞功能的強弱變化[15]。Foxp3通過直接或間接激活和抑制數(shù)百個基因來控制Treg細胞發(fā)育和發(fā)揮生物學功能。

IL-10和TGF-β是Treg細胞主要釋放的2個發(fā)揮免疫抑制功能的細胞因子，以避免機體產生過度的免疫反應。我們的結果發(fā)現(xiàn)布魯菌病組患者的血漿中的IL-10的水平明顯高于健康對照組，并且IL-10的增高水平與Treg細胞數(shù)量呈正相關，這說明Treg細胞增多并上調IL-10水平來發(fā)揮抑制功能。Treg細胞通過產生IL-10來發(fā)揮負向調節(jié)效應T細胞的功能。Manuel RZ等[16]曾報道IL-10在布魯氏菌持續(xù)感染中增高。我們前期也報道了布魯氏菌感染者血清中TGF-β的水平也顯著增高[17]，結合本文發(fā)現(xiàn)的Treg細胞比例增加的情況，我們認為布魯氏菌感染機體后，細菌會誘導宿主免疫應答向負向免疫發(fā)展，進而延緩宿主對布魯氏菌的清除，最終導致布病遷延不愈。

我國北方農牧地區(qū)布魯氏菌感染者較多，慢性患者眾多。我們的研究顯示Treg功能表達過度可能是布魯氏菌發(fā)生持續(xù)感染的原因之一。布魯氏菌感染后出現(xiàn)Treg細胞數(shù)量增多，F(xiàn)oxp3基因表達上調以及IL-10水平增高的現(xiàn)象，這些結果導致了布魯氏菌免疫應答的有害作用。通過本研究我們認為布魯氏菌感染機體后，布魯氏菌會誘導宿主免疫應答向負向免疫發(fā)展，進而延緩宿主對布魯氏菌的清除，最終導致布病遷延不愈。通過抑制Treg細胞或功能的免疫治療手段已經嘗試用于腫瘤等疾病的治療[18]。因此，掌握布病持續(xù)感染時Treg的變化特點、了解Treg在布魯氏菌中的作用，通過免疫手段抑制或阻斷Treg數(shù)量和功能有望成為布病免疫治療的潛在靶點，為控制布魯氏菌持續(xù)感染帶來新的思路。

利益沖突：無