楊曉雯，趙鴻雁，樸東日，田國(guó)忠，姜 海

布魯氏菌(Brucella)是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，易造成宿主持續(xù)性感染，引起全球性人獸共患流行性疾病—布魯氏菌病。該病主要表現(xiàn)為發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，嚴(yán)重者喪失勞動(dòng)能力，影響公共衛(wèi)生安全以及經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1]。基于生化鑒定和宿主偏好性，國(guó)際上將布魯氏菌分為12個(gè)種[2-6]。人感染布魯氏菌若診療不及時(shí)，容易引起各種并發(fā)癥，如脊柱炎、心內(nèi)膜炎、腦炎等[7]。全球人間布魯氏菌病發(fā)病率年平均超過(guò)50萬(wàn)例，一些流行國(guó)家每百萬(wàn)人口的布魯氏菌發(fā)病率超過(guò)100[8]，但據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查表明，實(shí)際發(fā)病率是報(bào)告的10～25倍[9]。2019年我國(guó)人間布魯氏菌病發(fā)病數(shù)為45 406例，較2018年略有下降(39 296例)。我國(guó)過(guò)去流行的主要種型是羊種布魯氏菌1型和3型[10]，近幾年主要分離株為羊種3型[11]。

臨床治療布魯氏菌病常用利福平、鏈霉素等[12]，氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物可以作為替代藥物[13]。1989年，世界衛(wèi)生組織推薦的布魯氏菌病治療方案為強(qiáng)力霉素—利福平聯(lián)合用藥6周，或者強(qiáng)力霉素服用6周，結(jié)合鏈霉素聯(lián)合用藥2～3周[14]，目前該方案仍在使用。目前，土耳其[15]、埃及[16]等國(guó)家和地區(qū)[17-22]已經(jīng)出現(xiàn)利福平抗性布魯氏菌，我國(guó)近年來(lái)也有相關(guān)利福平抗性分離株的報(bào)道[23]。利福平抗性基因rpoB突變后能夠產(chǎn)生抗性菌株。布魯氏菌基因組中是否有其他基因參與利福平代謝尚無(wú)報(bào)道。本研究選擇羊種3型代表菌株，利用人工誘變技術(shù)獲得利福平抗性菌株，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選利福平代謝相關(guān)基因，預(yù)測(cè)利福平代謝的主要代謝途徑。旨在為布魯氏菌耐藥相關(guān)基因的篩選提供新思路，為布魯氏菌耐藥菌株的防控提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1布魯氏菌菌株和基因組 羊種布魯氏菌3型標(biāo)準(zhǔn)菌株于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所BSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傳代培養(yǎng)，其基因組序列及其氨基酸序列于NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫(kù)中下載(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/740/355/GCF_000740355.1_ASM74035v1/)，rpoB基因序列參考NCBI Gene數(shù)據(jù)庫(kù)中Gene ID: 29593532序列。

1.2MIC值檢測(cè) 劃線培養(yǎng)羊種布魯氏菌1型和3型菌株，取3～5個(gè)單菌落利用生理鹽水調(diào)整布魯氏菌比濁度為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，利?6孔凝集板倍比稀釋利福平至0.125～256 μg/mL，加入100 μL稀釋的待檢菌液(布魯氏菌量為1×105CFU/孔)，37 ℃培養(yǎng)48 h，質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌 ATCC 49619(參考CISL_M45(2016))，同時(shí)設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照。

1.3利福平抗性菌株誘導(dǎo) 配置含利福平0.125～256 μg/mL的布氏瓊脂培養(yǎng)基，劃線培養(yǎng)布魯氏菌后，取單菌落接種于含0.125 μg/mL利福平的布氏瓊脂培養(yǎng)基中，待其長(zhǎng)出單菌落后于相同濃度利福平培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，多次傳代，待其抗性表型穩(wěn)定后再接種于高利福平濃度的培養(yǎng)基中，同時(shí)利用未添加利福平的布氏瓊脂培養(yǎng)基做對(duì)照，檢測(cè)單菌落生長(zhǎng)速度。

1.4紙片法藥敏檢測(cè) 劃線培養(yǎng)羊種3型布魯氏菌菌株，取3～5個(gè)單菌落利用生理鹽水調(diào)整布魯氏菌比濁度為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，取調(diào)整后布魯氏菌菌液100 μL溶解于含0.7%瓊脂的半固體布氏瓊脂培養(yǎng)基，使菌液均勻分布于整個(gè)培養(yǎng)基中，選擇利福平藥敏片(OXID)貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)48 h，檢測(cè)抑菌圈大小。

1.5RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期的菌株中加入2倍體積RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen)，混勻后室溫孵育5 min，5 000 ×g離心10 min收集沉淀，Trizol法抽提細(xì)菌總RNA；利用DNA酶消化提取的樣品總RNA，利用NanoDrop檢測(cè)總RNA OD260/280(≥1.8)和OD260/230(≥1.8)、Algilent 2100檢測(cè)總RNA濃度(≥40 ng/μL)、23S/16S(≥1.0)、RIN值(≥7.0)，檢測(cè)合格后送交華大基因有限公司測(cè)序。每個(gè)樣品重復(fù)3次后混合。檢測(cè)合格的樣品利用磁珠法去除樣品中的rRNA后，然后進(jìn)行片段化處理。隨后合成雙鏈cDNA并進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，將構(gòu)建好的測(cè)序文庫(kù)使用HiSeq測(cè)序。

1.6轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 將獲得的原始數(shù)據(jù)過(guò)濾掉低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過(guò)高的reads，得到可用數(shù)據(jù)。使用Bowtie2[24]軟件將可用數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因，之后再使用RSEM[25]軟件包計(jì)算基因的表達(dá)水平，篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因做深入的聚類分析和功能富集分析等。

1.7RpoB基因突變檢測(cè) 針對(duì)rpoB基因全長(zhǎng)序列和高變位點(diǎn)利用primer 5設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL，擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(高變位點(diǎn))/4 min(全長(zhǎng))，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物跑膠檢測(cè)大小無(wú)誤后送樣測(cè)序。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 利用excel2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)，利用R3.4.3程序繪制熱圖、venn圖等，利用R或者SPSS23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1人工誘導(dǎo)獲得利福平抗性菌株 利用稀釋法檢測(cè)羊種布魯氏菌3型標(biāo)準(zhǔn)菌株利福平MIC值，結(jié)果為0.5 μg/mL，表明該菌株沒(méi)有利福平抗性。經(jīng)多次傳代誘導(dǎo)，最終獲得了能夠在256 μg/mL利福平布氏瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的布魯氏菌菌株(圖1)。該菌株利福平抗性表型穩(wěn)定，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，在布氏瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)及速度差異不明顯。擴(kuò)增rpoB基因高變區(qū)測(cè)序結(jié)果表明，rpoB基因1606位點(diǎn)由C變?yōu)門(mén)，基因全長(zhǎng)測(cè)序表明，除1 606位點(diǎn)外，rpoB基因其余位點(diǎn)未出現(xiàn)變異。以上結(jié)果表明，通過(guò)不同濃度的利福平人工誘變，能夠獲得抗性表型穩(wěn)定的布魯氏菌變異菌株。

(左)人工誘變布魯氏菌利福平抗性菌株和(右)布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株

2.2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析標(biāo)準(zhǔn)菌株和利福平抗性菌株全基因組水平的基因表達(dá)量變化。原始測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾后獲得對(duì)照菌株(BM3T)6 845 213條reads，抗性菌株(BM3256)7 324 536條reads，覆蓋基因組分別為98.64%和98.38%。檢測(cè)基因的表達(dá)量可知，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，利福平抗性菌株中121個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，197個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)(圖2)。

圖2 利福平抗性菌株差異表達(dá)基因聚類熱圖

2.3差異基因功能分析 將差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO(gene ontology)和KEGG功能聚類分析。121個(gè)表達(dá)量上調(diào)的基因中，85個(gè)能夠比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，分子功能占84.7%，細(xì)胞成分占47.1%，生物過(guò)程占57.6%。分子功能中主要集中于催化活性和結(jié)合功能；細(xì)胞成分中主要集中于膜、膜成分和細(xì)胞；生物過(guò)程主要集中于代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程。197個(gè)表達(dá)量上調(diào)的基因中，144個(gè)能夠比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，分子功能占76.4%，細(xì)胞成分占51.4%，生物過(guò)程占57.6%。GO功能分類基本與上調(diào)基因功能類似，但部分功能如細(xì)胞器、細(xì)胞器組分、結(jié)構(gòu)分子活性未在表達(dá)量上調(diào)的基因中發(fā)現(xiàn)(圖3)。

注：A為表達(dá)量上調(diào)基因的GO功能分析，B為表達(dá)量下調(diào)基因的GO功能分析。

KEGG功能聚類分析中，表達(dá)量上調(diào)的基因參與的KEGG代謝通路主要集中于不同環(huán)境中的微生物代謝、碳代謝和抗生素的生物合成；表達(dá)量下調(diào)的基因參與的KEGG代謝通路則主要集中于細(xì)菌分泌系統(tǒng)、磷酸肌醇代謝和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)(圖4)。

注：A為表達(dá)量上調(diào)基因的KEGG功能分析，B為表達(dá)量下調(diào)基因的KEGG功能分析。

參與催化活性、結(jié)合、細(xì)胞成分、膜和細(xì)胞成分、代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程的基因在利福平存在的條件下差異表達(dá)，這些基因參與碳代謝、抗生素的生物合成、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、磷酸肌醇代謝和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等代謝通路。以上結(jié)果表明，布魯氏菌通過(guò)多種代謝途徑來(lái)代謝/抵御利福平的作用。

2.4差異基因相關(guān)性分析 將差異表達(dá)基因比對(duì)至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，利用與已知蛋白的同源性獲得基因間的互作關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)量下調(diào)的基因中，存在互作相關(guān)蛋白，經(jīng)同源篩選發(fā)現(xiàn)11個(gè)互作基因，屬于virB操縱子，編碼IV型分泌系統(tǒng)(圖5)。

注：A為表達(dá)量上調(diào)基因的互作關(guān)系圖，B為表達(dá)量下調(diào)基因的互作關(guān)系圖。

3 討 論

利福平屬于利福霉素抗生素組，通過(guò)阻斷細(xì)菌RNA和蛋白質(zhì)合成引發(fā)其殺菌作用，布魯氏菌利福平抗性相關(guān)基因rpoB基因編碼DNA依賴性的RNA聚合酶β亞基，該基因突變后導(dǎo)致菌株對(duì)利福平的親和力降低[26]。對(duì)羊種和牛種布魯氏菌的研究表明，rpoB基因存在影響利福平抗性水平的高變位點(diǎn)(1 560-1 740位點(diǎn))[27]。本研究的結(jié)果與前人研究結(jié)果[27]類似，人工誘變的利福平抗性布魯氏菌rpoB基因1 606位點(diǎn)出現(xiàn)單核苷酸突變。由于針對(duì)布魯氏菌的研究需要生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室(Biosafety Level-3，BSL-3)，因此，常規(guī)的耐藥研究很少涉及布魯氏菌。目前的研究表明，布魯氏菌耐利福平與rpoB基因突變相關(guān)[27]，其他基因的表達(dá)量變化是否影響布魯氏菌利福平抗性表型尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，virB操縱子等基因與利福平抗性相關(guān)。

IV型分泌系統(tǒng)是多蛋白復(fù)合物，存在于許多革蘭氏陰性菌中，如根瘤菌、幽門(mén)螺旋桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌和布魯氏菌等[28]。IV型分泌系統(tǒng)允許底物通過(guò)細(xì)胞膜，將分泌性蛋白釋放到宿主細(xì)胞中，同時(shí)，在接合、DNA攝取和釋放等方面也發(fā)揮重要作用，是布魯氏菌重要的毒力因子，是由virB操縱子編碼[29]。本研究中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，virB操縱子在利福平抗性菌株中表達(dá)量下調(diào)。virB操縱子包括12個(gè)基因，即virB1-12，與細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和形成持續(xù)性感染有關(guān)[30]。布魯氏菌侵入宿主細(xì)胞后，形成含有布魯氏菌液泡(Brucella-containing vacuole，BCV)，BCV與溶酶體融合，大約90%的BCV被吞噬溶酶體降解，剩余10%的BCV可能通過(guò)酸化機(jī)制逃避宿主免疫機(jī)制，隨后觸發(fā)virB操縱子釋放大量分泌性蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)中[31]。virB操縱子中不同的基因功能不同，virB1可能影響著其它virB蛋白，virB6、virB7和virB10蛋白是細(xì)菌跨膜蛋白的傳送信號(hào)，VirB4和VirB11蛋白與VirD4蛋白偶聯(lián)使ATP酶從表面跨膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，virB2和virB5蛋白可能是細(xì)菌表面菌毛結(jié)構(gòu)蛋白，virB8在IV型分泌系統(tǒng)中起主要作用, 主要是與virB9和virB10在細(xì)胞膜上形成群體[32]，virB3和virB12功能尚不明確，推測(cè)可能與復(fù)合體的裝配有關(guān)[33]。IV型分泌系統(tǒng)是布魯氏菌毒力的重要組成部分，對(duì)于布魯氏菌的胞內(nèi)寄生和逃逸宿主免疫具有重要的作用。當(dāng)前對(duì)于IV型分泌系統(tǒng)的組成及編碼相關(guān)基因的功能研究較為明確。本研究中發(fā)現(xiàn)，利福平抗性菌株中virB操縱子的表達(dá)量降低，推測(cè)布魯氏菌virB操縱子與利福平抗性相關(guān)，通過(guò)降低virB操縱子基因的表達(dá)來(lái)抵御利福平的作用。

綜上，本研究通過(guò)不同濃度的利福平人工誘變，能夠獲得抗性表型穩(wěn)定的布魯氏菌變異菌株。同時(shí)，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)利福平抗性菌株中121個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，197個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)，差異基因功能主要集中于催化活性、結(jié)合、細(xì)胞成分、膜和細(xì)胞成分、代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程；主要參與碳代謝、抗生素的生物合成、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、磷酸肌醇代謝和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等代謝通路。包括virB操縱子在內(nèi)的涉及碳代謝等代謝通路的基因，通過(guò)表達(dá)量的改變參與抵抗利福平的作用。本研究通過(guò)人工誘變菌株的全轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)為布魯氏菌耐藥相關(guān)基因的篩選提供新思路，篩選出的差異表達(dá)基因作為布魯氏菌利福平抗性候選基因，為布魯氏菌利福平抗性的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為布魯氏菌耐藥菌株的防控提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

利益沖突：無(wú)