邢 燕，錢玉春，張文艷，胡忠旺，孫 永

沙門菌是一類重要的人獸共患病原體，血清型多達(dá)2 000多種，其中絕大多數(shù)血清型既可存在于動(dòng)物、環(huán)境中，也可傳播至人。沙門菌感染會(huì)引起腹瀉、發(fā)熱等癥狀[1]，屬于自限性疾病，但對(duì)于細(xì)菌入血的少數(shù)重癥患者，必須使用抗生素治療。

喹諾酮類抗生素是成人治療沙門菌感染的一線藥物之一。沙門菌對(duì)喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥對(duì)于治療非常不利。目前沙門菌對(duì)一代藥物萘啶酸已表現(xiàn)出明顯耐藥，對(duì)第三代藥物環(huán)丙沙星的敏感性仍較高，耐藥率大約在2%～3%[2-3]。

對(duì)喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的研究表明，喹諾酮耐藥決定區(qū)的基因突變，即位于細(xì)菌染色體上的gyrA、gyrB基因的突變，是導(dǎo)致喹諾酮耐藥的主要原因[4]。隨著研究的深入，由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥相關(guān)基因，如qnr、aac(6′)-Ib-cr、qepA等都被發(fā)現(xiàn)與喹諾酮耐藥有關(guān)[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥通常引起喹諾酮類藥物的MIC濃度降低或藥物敏感性下降，不能達(dá)到臨床耐藥水平[8-10]。但Toyotakasato[11]等人于2011年報(bào)道了一例臨床分離的大腸桿菌HUE1，它不含染色體編碼基因的耐藥突變，僅有質(zhì)粒上攜帶的基因qnrS1和oqxAB并表現(xiàn)出環(huán)丙沙星耐藥。

本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)臨床分離沙門菌菌株的抗生素耐藥篩查中，發(fā)現(xiàn)一株多耐藥菌株SM846，它對(duì)喹諾酮類藥物萘啶酸和環(huán)丙沙星都耐藥，在PCR研究耐藥機(jī)制時(shí)，沒有檢測(cè)到gyrA和gyrB基因的突變。隨后對(duì)它進(jìn)行了全基因組測(cè)序及序列比較分析，來研究它的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1菌株來源及分離鑒定 沙門菌SM846于2014年從1名11個(gè)月的嬰兒腹瀉糞便標(biāo)本中分離。沙門菌從沙門顯色培養(yǎng)基(購(gòu)于上?？岂R嘉)中分離出單個(gè)菌落，純菌落使用梅里埃的微生物鑒定系統(tǒng)(購(gòu)于梅里埃VITEK2)鑒定，經(jīng)血清學(xué)(購(gòu)于寧波天潤(rùn))鑒定為湯普遜沙門菌(S.thompson)。

1.2藥敏試驗(yàn) 使用thermo公司的SensititreAIM儀器和基于微量肉湯法定制的藥敏板(購(gòu)于上海星佰)，測(cè)定沙門菌SM846對(duì)14種抗生素的最低抑菌濃度(MIC)。試驗(yàn)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用無菌生理水調(diào)整菌懸液濃度至0.5McF，取50 μL菌懸液加入到11 mL CAMHT肉湯中，將稀釋后的菌液(細(xì)菌數(shù)1×105～1×106)接種在藥敏板上。培養(yǎng)24 h，測(cè)定結(jié)果。使用大腸桿菌ATCC25922為試驗(yàn)的質(zhì)控菌株。14種抗生素分別為：氨芐西林(AMP)、氨芐西林/舒巴坦(AMS)、四環(huán)素(TET)、氯霉素(CHL)、頭孢唑林(CFZ)、環(huán)丙沙星(CIP)、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑(SXT)、頭孢他啶(CAZ)、亞胺培南(IPM)、萘啶酸(NAL)、頭孢西丁(CFX)、頭孢噻肟(CTX)、慶大霉素(GEN)、阿奇霉素(AZM)。根據(jù)CLSI的判讀標(biāo)準(zhǔn)確定MIC值。

1.3全基因組測(cè)序 對(duì)于組裝基因組的菌株，提供8～10 μg高質(zhì)量的基因組DNA，用Covaris g-TUBE隨機(jī)打斷成10 kb左右的片段，隨后用DNA Template Prep試劑盒構(gòu)建SMRTbell文庫(kù)。構(gòu)建好的SMRTbell文庫(kù)結(jié)合V3測(cè)序引物和聚合酶采用自由擴(kuò)散的方式加入到PacBio Sequel平臺(tái)的測(cè)序芯片中。測(cè)序過程由金唯智公司處理和分析。

1.4測(cè)序后數(shù)據(jù)分析 使用Prodigal軟件(version 3.02)進(jìn)行染色體編碼基因預(yù)測(cè)[12]；與Rfam(version 12.0)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)獲得非編碼RNA結(jié)果[13]。使用在線網(wǎng)站RAST對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行注釋[14]。使用resfinder[15]與CARD[16]進(jìn)行耐藥基因的預(yù)測(cè)分析。使用SISTR[17]預(yù)測(cè)血清型，PlasmidFinder預(yù)測(cè)質(zhì)粒類型[18]。使用SnapGene(from GSL Biotech; available at snapgene.com)對(duì)質(zhì)粒的編碼基因進(jìn)行展示?；蚪M線圖使用CGView1.3.4[19]生成。質(zhì)粒上耐藥基因圖由ApE軟件制作(available at https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/)。質(zhì)粒序列使用clustalw進(jìn)行比對(duì)(available at https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，進(jìn)化樹由軟件mega-X根據(jù)NJ法生成[20]。

2 結(jié) 果

2.1測(cè)序菌株信息 SM846的全基因組包含1條染色體和1條質(zhì)粒。染色體全長(zhǎng)4 754 945 bp，GC含量52.3%，預(yù)測(cè)包含編碼序列4 425個(gè)，含64個(gè)rRNA，89個(gè)tRNA，其它RNA178個(gè)。質(zhì)粒全長(zhǎng)152 940 bp，GC含量53.4%，預(yù)測(cè)包含編碼序列193個(gè)，不含RNA。染色體和質(zhì)?；蚪M已提交到NCBI，序列號(hào)分別為：CP028729、CP029249?；赟ISTR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的血清型為湯普遜，與血清學(xué)鑒定結(jié)果一致?；赑lasmidFinder質(zhì)粒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的質(zhì)粒類型為IncA/C2。SM846測(cè)序原始數(shù)據(jù)見表1。

表1 SM846測(cè)序原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)信息

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果與耐藥基因分布

2.2.1藥敏試驗(yàn) SM846對(duì)IPM、GEN敏感，對(duì)其它12種抗生素都高度耐藥，包括喹諾酮藥物萘啶酸和環(huán)丙沙星。雖然SM846對(duì)喹諾酮耐藥，PCR檢測(cè)gyrA和gyrB基因的耐藥突變，沒有獲得任何突變位點(diǎn)的結(jié)果。對(duì)SM846進(jìn)行了基因組測(cè)序以研究它的喹諾酮耐藥機(jī)制(詳見表2)。

表2 SM846藥敏試驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)耐藥基因

2.2.2耐藥基因分布 將SM846序列與ResFinder數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，注釋結(jié)果顯示，SM846的染色體不含有任何和已知耐藥有關(guān)的基因和突變，它有3個(gè)parC蛋白的未知突變，分別是p.T57S、p.T255S、p.V657I。它的質(zhì)粒p846攜帶13個(gè)耐藥相關(guān)基因，分別是耐氨基糖苷類的aadA2、APH(6)-1d、APH(3″)-1b；耐氯霉素的floR；耐β-內(nèi)酰胺類的blaTEM-1、blaCMY-2；耐喹諾酮類的qnrS1和qepA1；耐大環(huán)內(nèi)酯類mph(A)；耐磺胺類的sul1、sul2；耐四環(huán)素類tet(A)；以及耐甲氧嘧啶的dfrA12(見表1)。由于ResFinder和CARD對(duì)耐藥基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)有差別，ResFinder比對(duì)的是明確并且特異地與耐藥相關(guān)的耐藥基因，而CARD數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果中還包括外排泵系統(tǒng)和基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)等非特異的基因。CARD數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果，除了包含ResFinder中的耐藥基因，還有30個(gè)位于染色體上的基因，分別屬于RND抗生素外排泵、ABC抗生素外排泵、MFS抗生素外排泵、以及上述外排泵基因上下游的正負(fù)調(diào)控基因。

2.3 耐多藥質(zhì)粒信息

2.3.1由于SM846的耐藥基因，包括與喹諾酮耐藥相關(guān)的基因，都在質(zhì)粒上，我們對(duì)質(zhì)粒p846進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。p846共編碼193個(gè)基因，去除小于100 bp和沒有明確功能的，還有159個(gè)。其中13個(gè)基因與耐藥相關(guān)。

將p846的序列與NCBI上其它公開數(shù)據(jù)比對(duì)，可以得到很多相似度大于99%的質(zhì)粒。表3中列出了代表性的13條質(zhì)粒，分別是4條相似度最高的和9條覆蓋度最高的序列。用ResFinder注釋上述質(zhì)粒的耐藥基因，獲取它們的耐藥基因的攜帶情況(表3)。

表3 p846與相似質(zhì)粒比較

上述質(zhì)粒中，分離時(shí)間早的，如分離自2003年和2004年的質(zhì)粒。耐藥性都相對(duì)較弱，2013年及以后分離出的則表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐藥性；質(zhì)粒菌株來自于人的，耐藥性也強(qiáng)，由于中國(guó)分離出的質(zhì)粒都是2010年以后且自人體分離出，因此中國(guó)分離的質(zhì)粒都顯示出了很強(qiáng)的耐藥性。以質(zhì)粒的序列進(jìn)行進(jìn)化分析，可以得到2個(gè)進(jìn)化簇(見圖1)。與p846親緣關(guān)系近的質(zhì)粒有3個(gè)，分別是pCVMN1543、pCFSAN00093402和pRH-1238。其中p846和pRH-1238耐藥性極強(qiáng)，pCVMN1543、pCFSAN000934-02耐藥性一般；p846來自于人分離的菌株，其它3個(gè)來自于動(dòng)物分離的菌株；p846來自中國(guó)，pRH-1238來自德國(guó)，pCVMN1543和pCFSAN000934-02來自美國(guó)。

進(jìn)化分析序列基于以下質(zhì)粒序列：p846，pSN254b，p2012EL-2176，pSL131，punnamed3，pTB221，pCVM22425，pCMY2 085072，pCFSAN007427 01，pCVM22513，pCVMN1543，pCFSAN000934 02，pRH-1238。

為了更深入研究p846的遺傳情況，將p846與上面的質(zhì)粒進(jìn)行序列對(duì)比分析。從對(duì)比的圈圖，可以看出p846含有2個(gè)較為特殊的區(qū)域，P1和P2。pCFSAN007427.01也含有P1區(qū)域，它是一條分離自2009年的美國(guó)的沙門菌的質(zhì)粒(見圖2)。在NCBI搜索P1序列，發(fā)現(xiàn)很多宿主細(xì)菌的質(zhì)粒中都含有這段序列，如沙門菌、志賀菌、肺炎鏈球菌等。與P1序列的廣泛存在不同，P2序列特異性較強(qiáng)，它與NCBI中的序列沒有很好的匹配。QepA1和qnrS1基因位于P2序列中，它們正是質(zhì)粒中與喹諾酮耐藥相關(guān)的2個(gè)基因。QnrS1在沙門菌質(zhì)粒中分布較為普遍[21]，而qepA1未在耐喹諾酮的沙門菌中發(fā)現(xiàn)過。

由內(nèi)而外分別是GC content、pAR060302、pSN254b、p2012EL-2176、 punnamed3、 pTB221、pCFSAN007427.01、pRH-1238、pCMY2 085072、pSL131、pCFSAN000934_02、 pCVMN1543、pCVM22425、 pCVM22513、 p846。P1和P2是p846中未比對(duì)上的序列。

P2序列全長(zhǎng)32 048 bp，GC含量57%。共編碼42個(gè)基因，其中13個(gè)是和基因移動(dòng)相關(guān)的，如解離酶、轉(zhuǎn)化酶、內(nèi)含子等。攜帶6個(gè)耐藥基因——qnrS1、qepA1、dfrA12、sul1、aadA12和mph(a)，分別編碼對(duì)喹諾酮類、氨基糖苷類、甲氧嘧啶類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥(見圖3)。P2主要由I類整合子構(gòu)成，包括它的5′端的intI整合酶及3′端的sul1和溴乙錠的耐藥基因以及兩者之間的可變區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)，I類整合子的可變區(qū)包含的幾乎都是與耐藥相關(guān)的基因[22]。在P2的I類整合子序列里，可變區(qū)包含耐藥基因qepA1、dfrA12和aadA2。P2序列的兩端均有IS6和反向重復(fù)序列，提示3′端的qnrS1、5′端的mph(a)基因可能與此相關(guān)。這些插入或整合到I類整合子的耐藥基因的存在，使細(xì)菌獲得在抗生素壓力下的生存優(yōu)勢(shì)。

紅色為可移動(dòng)蛋白；灰色為IR、IS及Tn等可移動(dòng)元件箭頭方向?yàn)榛蚓幋a方向

3 討 論

根據(jù)Resfinder的注釋，parC基因含有3個(gè)未知突變p.T57S、p.T255S、p.V657I。經(jīng)過分析，認(rèn)為它們對(duì)于蛋白結(jié)構(gòu)的變化影響不大，與喹諾酮耐藥無關(guān)。有以下原因：首先從氨基酸化學(xué)性質(zhì)分析，T和S、V和I都是化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸，不會(huì)引起蛋白質(zhì)局部電荷以及疏水性質(zhì)的變化；其次，在Uniport網(wǎng)站搜索到蛋白ParC，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的影響功能的氨基酸突變都有標(biāo)注，可以參考，而它不含以上3個(gè)突變；第三是從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上，雖然沙門氏菌的parC結(jié)構(gòu)未被解析，但和它高度同源的大腸桿菌ParC結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，這些殘基并不位于關(guān)鍵的結(jié)合界面，不會(huì)影響蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；最后,這幾個(gè)突變位點(diǎn)與同期測(cè)序的實(shí)驗(yàn)室其它對(duì)喹諾酮敏感菌株的突變位點(diǎn)相同(數(shù)據(jù)未列出)，可以說明這些突變對(duì)于喹諾酮耐藥是不起作用的，并且p.T57S位點(diǎn)的突變?cè)谖墨I(xiàn)中已經(jīng)有多次報(bào)道，證實(shí)其對(duì)喹諾酮耐藥是無效的[23]。

綜合染色體和質(zhì)粒序列耐藥基因的注釋結(jié)果，可以確定SM846基因組中和喹諾酮耐藥有關(guān)基因有acrAB-TolC、sdiA、marR,、marA、qnrS1、qepA1。SdiA位于染色體上，它的作用是無效的[24]。MarR、marA都是編碼acrAB的調(diào)控蛋白[25]。QepA1曾在敏感的臨床鼠傷寒沙門菌中檢測(cè)出，說明qepA1單獨(dú)存在不能介導(dǎo)對(duì)喹諾酮耐藥，這與大腸中qepA的研究結(jié)果一致[21-23]。SM846的喹諾酮耐藥可能是由acrAB外排泵，QnrS1靶位結(jié)合蛋白和qepA1外排泵共同作用來實(shí)現(xiàn)。QnrS1或者qepA1或者acrAB單獨(dú)存在于沙門菌中，均沒有對(duì)喹諾酮藥物產(chǎn)生耐藥性的能力。它們組合在一起的具體作用方式，是否與Sato[11]報(bào)道的大腸桿菌HUE1的耐藥機(jī)制類似，還需要更多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

對(duì)IncA/C2質(zhì)粒的分析表明，不同來源的質(zhì)粒，都能在寄生于人和動(dòng)物的病原體中傳播。當(dāng)同一型的質(zhì)粒位于不同地區(qū)時(shí)，它們所攜帶的耐藥基因的數(shù)量和種類會(huì)發(fā)生改變，使宿主獲得不同的耐藥能力，說明同源性強(qiáng)的質(zhì)?？赏ㄟ^靈活獲取耐藥基因更好的實(shí)現(xiàn)本地化生存[26]。Han等[26]分析了4條質(zhì)粒并與之前發(fā)表的質(zhì)粒進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)相似質(zhì)粒之間的獨(dú)特性是由可移動(dòng)部分造成的。在SM846中也是如此。p846及相似的質(zhì)粒，質(zhì)粒骨架(backbone)區(qū)域在時(shí)間跨度十幾年間，相似度達(dá)99%，相對(duì)保守。IncA/C2型質(zhì)粒骨架不含qnrS1和qepA1基因，推測(cè)抗生素或其它壓力可能促使細(xì)菌在可移動(dòng)元件的幫助下快速獲得相應(yīng)的耐藥基因，提高細(xì)菌的生存能力。

通過質(zhì)粒信息的比對(duì)我們發(fā)現(xiàn)來自于臨床樣本的質(zhì)粒，它們的宿主細(xì)菌種類比動(dòng)物和環(huán)境來源的樣本要更多樣，也就意味著多耐藥的質(zhì)粒能通過多種病原菌感染人類。應(yīng)當(dāng)注意到，共同的問題包含著不同的細(xì)節(jié)，不同地區(qū)的生態(tài)因素和選擇壓力造成了某一地區(qū)獨(dú)特的耐藥模式[27-28]。一項(xiàng)根據(jù)基因組序列分析多耐藥沙門菌的研究表明，不同地區(qū)的耐藥相關(guān)的特征在基因型和表現(xiàn)型上都表現(xiàn)出了地區(qū)差異[27]。因此需要建立地區(qū)性的耐藥監(jiān)測(cè)和耐藥控制策略，我們的質(zhì)粒比對(duì)結(jié)果也支持這個(gè)觀點(diǎn)。在p846相似的質(zhì)粒中，耐藥相關(guān)性最強(qiáng)的質(zhì)粒來自中國(guó)和海地，這2個(gè)國(guó)家都是經(jīng)濟(jì)不夠發(fā)達(dá)，在抗生素使用管理上可能不夠完善，這兩個(gè)地區(qū)的細(xì)菌耐藥性更強(qiáng)，不適宜直接套用發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)于抗生素管理和控制的策略，因?yàn)樗鼈兊牟呗允墙⒃谧约旱募?xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)的結(jié)果上的。值得一提的是分離自德國(guó)的質(zhì)粒pRH-1238，它攜帶的耐藥基因數(shù)量最多，達(dá)到20個(gè)，所屬的抗生素類型也是最多，可耐9種類型的抗生素。對(duì)這條質(zhì)粒上耐藥基因fosA3的分析表明，它很可能來自中國(guó)[29]。我們根據(jù)基因組序列所做的進(jìn)化分析顯示,德國(guó)分離的pRH-1238與中國(guó)分離的p846在進(jìn)化上確實(shí)屬于一個(gè)分支，支持了這個(gè)質(zhì)?？赡芘c中國(guó)有關(guān)的結(jié)論。因此，不同地區(qū)的細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)是必要的，各地區(qū)自己的耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果才是制定其耐藥策略的最合理的依據(jù)，也只有根據(jù)合理的依據(jù)，才能得到有效的控制策略，切實(shí)減輕疾病負(fù)擔(dān)。SM846攜帶qnrS1和qepA1來介導(dǎo)對(duì)喹諾酮的耐藥，這個(gè)發(fā)現(xiàn)正是我們監(jiān)測(cè)的成果之一。

利益沖突：無