唐媚娜，何 偉，肖衛(wèi)紅，熊 銀，饒亞華，胡志敏

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)是引起戊型肝炎(Hepatitis E,HE)的病原體，經(jīng)糞-口途徑傳播。在發(fā)展中國家，戊型肝炎是一個重要的公共衛(wèi)生問題，我國是HEV的流行區(qū)。HEV是單股正鏈RNA病毒，呈球形、直徑27～34 nm，無包膜，核衣殼呈二十面體立體對稱?；蚪M長約7.2 kb，3′端有poly A尾，有3個開放閱讀讀框(Open Reading Frame, ORF)。HE是一種自限性傳染病，主要導致隱性感染及急性肝炎，一般不發(fā)展為慢性肝炎。戊型肝炎在15～39歲的青年和成人高發(fā)，孕婦罹患率高，且病情嚴重，在妊娠的后3個月發(fā)生感染病死率可達20%[1]。有研究表明，它與器官移植患者、免疫抑制患者以及老年人的戊型肝炎慢性化有關[2-3]。

RNA-Seq，即RNA測序，又稱轉(zhuǎn)錄組測序，是最近發(fā)展起來的利用深度測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)。通過Illumina高通量測序平臺，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行測序，再通過直接比對該基因組區(qū)域的reads數(shù)來衡量其轉(zhuǎn)錄水平。近年來，隨著大規(guī)模測序技術(shù)的不斷發(fā)展，RNA-Seq技術(shù)被廣泛應用于各類研究領域，極大地改變了轉(zhuǎn)錄組研究的前景[4-5]。與基因芯片相比，RNA-Seq技術(shù)可定量研究RNA的表達水平，其結(jié)果更為準確，且方便在實驗結(jié)果間進行直接比較。通過RNA-Seq技術(shù)可準確測定特異基因的表達水平、差異剪接和等位基因轉(zhuǎn)錄本的特異表達，來說明許多生物相關的問題[6]。目前RNA-Seq技術(shù)廣泛應用于差異表達基因的篩選，并且可用于健康組織與疾病組織之間基因表達差異的研究[7]。

為了更好地了解感染后發(fā)生的即時變化，本研究基于RNA測序 (RNA-Seq)，在基因水平上對HEV感染前后HepG2細胞的差異表達基因進行研究，旨在篩選出與HEV感染相關的候選基因，從而為今后深人研究HEV感染相關的基因及其功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病毒株與細胞 HepG2細胞株購自上海中科院細胞庫。HEV genotype-3 Kernow-C1/p6病毒株來自武漢大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學病毒研究所，滴度約為3×108pfu/mL。

1.2試劑與耗材 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基、 胎牛血清(Fetal Bovine Serum)及胰蛋白酶 (Trypsin)均購自GIBCO公司(Grand Island, NY, USA)；總RNA提取Trizol Regent購自Thermo公司(Waltham, MA, USA)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with cDNA Eraser購自Takara公司(Shiga, Japan)；mRNA純化試劑盒(Dynabeads mRNA direct Purification Kit)購自Thermo公司；NanoDropND-1000分光光度計購自Thermo公司。

1.3樣品獲取、處理與測序 感染前，將HepG2細胞均勻種植于48孔板，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(10% FBS/DMEM)，37 ℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。感染組4孔，對照組4孔(約 5×104cells/孔)。當細胞匯合度達到60%～70%后，感染組接種5×103GE(genome equivalents)/細胞的HEV genotype-3 Kernow-C1/p6病毒，對照組用等量4% PEG8000處理；感染4 h后，棄去培養(yǎng)基，以1×PBS洗滌3次后，加入新鮮10% FBS/DMEM 維持培養(yǎng)24 h[1 dpi(day(s)post infection)]后，收取第1批RNA；繼續(xù)培養(yǎng)48 h(3 dpi)后，收取第2批RNA；繼續(xù)培養(yǎng)48 h(5 dpi)后，收取第3批RNA；繼續(xù)培養(yǎng)48 h(7 dpi)后，收取第4批RNA。使用分光光度計檢測RNA的OD260/OD280及濃度。將符合純度及濃度要求的15 μg RNA用干冰保存送測序。

利用第二代高通量測序技術(shù)Illumina Hiseq 2000對HEV感染前后(感染前、后各4組)的HepG2細胞RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序由本實驗室自行完成。其中HEV-1、HEV-2、HEV-3、HEV-4為感染組，Mock-1、Mock-2、Mock-3、Mock-4為對照組。具體測序程序包括：提取總RNA并純化mRNA，將所得到的mRNA隨機打斷成片段，再用隨機引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA片段，再對cDNA片段進行末端修復，并連接測序接頭，富集純化的cDNA模板后用Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer對文庫進行質(zhì)檢，最后上機測序。

1.4免疫印跡和免疫熒光檢測感染細胞病毒表達 使用 2×SDS Sample buffer 裂解上述感染組及對照組(感染4 h后，棄去培養(yǎng)基，以1×PBS洗滌3次后，加入新鮮10% FBS/DMEM 維持培養(yǎng)24 h)細胞 10 min，超聲 5 s×3 次(無需 100 ℃變性)。使用 BCA 蛋白定量試劑盒進行定量，取 20 μg 總蛋白上樣(20 μg/孔)。根據(jù)分子克隆所示方法制備 8% SDS-PAGE 分離膠，5%堆積膠，以 80 V 恒壓電泳。290 mA，轉(zhuǎn)膜 2 h，封閉液(5%脫脂牛奶/PBS)封閉 1 h。5%BSA/PBS 稀釋的 Anti-pORF2 antibody 室溫孵育 1 h(1∶5 000)。0.1% Triton X-100/PBS 洗膜10 min×2次。5% BSA/PBS 稀釋的Anti-IgG-HRP antibody室溫孵育1 h。0.1% Triton X-100/PBS 洗膜 10 min×3 次，按 ECL 說明書配制 ECL 液，孵育膜 5 min。暗室中顯影，根據(jù)發(fā)光強弱調(diào)節(jié)壓片時間使條帶更清晰。

將細胞種植在加有滅菌圓形蓋玻片的 24 孔板中(約 1×105cells/孔)，按1.3中方法感染細胞，用 10% FBS/DMEM 培養(yǎng)于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。感染4 h后，棄去培養(yǎng)基，以1×PBS洗滌3次后，加入新鮮10% FBS/DMEM維持培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛/蔗糖/PBS固定15 min，PBS洗5 min×2次，0.1% Triton X-100/PBS 透化10 min，PBS洗10 min×2次；5% BSA/PBS封閉30 min；5% BSA/PBS稀釋的Anti-pORF2 antibody室溫孵育1 h(1∶500)；PBS洗5 min×5次；5% BSA/PBS 封閉20 min；5% BSA/PBS稀釋的Anti-IgG-cy2 antibody(1∶400)室溫孵育1 h；PBS洗5 min×7次；加入1 μg/mL的DAPI染核2 min；PBS洗5 min×2次；H2O洗1次。在載玻片上滴60%甘油4 μL，將蓋玻片從一側(cè)輕輕粘在載玻片上，在熒光顯微鏡上觀察pORF2的表達情況，用激光共聚焦顯微鏡掃描和照相。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析 用FastQC分析軟件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)對RNA-seq中測得的Raw data進行質(zhì)量控制和過濾，并去除帶接頭、含有poly-N以及低質(zhì)量reads形成純凈序列(Clean reads)；將得到的Clean Reads采用STAR軟件對RNA-seq數(shù)據(jù)進行比對(http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/)，mapping至人的參考基因組(GRCh38.p6 assembly of the human reference from NCBI, ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF)，所得的mapped Reads為有效測序量。

1.6差異表達基因篩選及基因功能和通路分析 對mapped reads進行基因表達定量，使用HTSeq (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count)分別對感染組樣本和對照組樣本進行reads計數(shù)。使用DESeq2(http://genomebiology.com)對感染組和對照組進行基因表達量比較，以差異倍數(shù)(Fold change)絕對值≥2且Padj<0.05(Padj是P值經(jīng)過多重校驗校正后的值)為標準計算出感染組樣本和對照組樣本的差異表達基因，并在DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行GO功能富集分析通路富集分析，采用Fisher檢驗計算每個GO的P值，篩選出差異基因富集的顯著性通路(P<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)量控制和短序列比對 感染組細胞成功感染HEV genotype-3 Kernow-C1/p6病毒(圖1)。

A為HEV感染組和對照組細胞免疫熒光，感染組成功感染病毒；B為感染組細胞感染后，1～7 d內(nèi)的HEV病毒載量；C為 Western Blot檢測細胞內(nèi)病毒pORF2表達情況。

從質(zhì)控結(jié)果可知，8個樣本測序結(jié)果均合格，可用于后續(xù)生物信息學分析。應用STAR軟件對預處理后的reads進行Genome mapping，將所得到的reads與人的參考基因進行比對(表1)。

表1 感染組與對照組測序reads比對

對mapped reads進行基因表達定量，使用HTSeq分別對實驗樣本和對照樣本進行reads計數(shù)，制作密度散點圖R-I (Ratio-intensity，圖2A)，顯示HEV感染組和對照組基因表達水平。

2.2差異表達基因篩選 由主成分分析圖(Principal Component Analysis，PCA，圖2B)可以看出，感染組和對照組在轉(zhuǎn)錄水平上具有明顯的差異。圖2C顯示，以FDR<0.1 (FDR是對P-value的校正值)且差異倍數(shù)絕對值≥2(Log2FC≥1或Log2FC≤-1)為條件進行篩選，共得到132個差異基因，其中，上調(diào)表達基因127個，下調(diào)表達基因5個。表2列出了差異倍數(shù)排名前10的基因列表。

A為密度散點圖，紅點表示HEV感染組的整體表達水平，黑點表示對照組的整體表達水平；B為主成分分析圖，藍點表示戊型肝炎感染組，紅點表示對照組；C為戊型肝炎病毒感染細胞與對照細胞差異基因表達的火山圖

2.3基因GO功能富集分析 如圖3A(生物學過程)和3B所示(分子功能)，顯示了部分差異表達基因功能富集結(jié)果。其中，橫軸代表功能顯著性水平(Padj)的-Log10P值；縱軸代表Gene Ontology數(shù)據(jù)庫中對應GO的條目名稱。由結(jié)果可知，在對差異表達基因進行的富集功能分類中，在生物學過程條目中排名前15位的GO分類分別為：病毒防御、I型干擾素信號通路、病毒基因組復制的負調(diào)控、抗病毒、IFN-γ介導的信號通路、固有免疫應答、IFN-α應答、I型干擾素產(chǎn)生的負調(diào)控作用、IFN-β應答、IFN-γ應答、免疫反應、炎癥反應、ISG15蛋白共軛、IFN-α的細胞應答及病毒轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控等；在分子倍數(shù)改變代表感染組和對照組基因表達量的差異倍數(shù)，校正后P值即該基因是否為差異表達基因的概率，P<0.05表示基因表達差異有統(tǒng)計學意義。

表2 差異倍數(shù)排名前10的基因列表

A為差異表達基因功能富集GO分析(生物學過程)結(jié)果示意圖；B為差異表達基因功能富集GO分析(分子功能)結(jié)果示意圖；C為通過DAVID 和KEGG數(shù)據(jù)庫獲取的差異表達基因的通路富集分析。

功能條目中排名前15位的GO分類分別為：雙鏈RNA結(jié)合、解旋酶活性、蛋白結(jié)合、NAD+ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性、單鏈RNA結(jié)合、2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性、RNA結(jié)合、GTP酶活性、鋅離子結(jié)合、泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、同一蛋白結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導活性、GTP結(jié)合、連接酶活性及受體結(jié)合等。

2.4信號通路分析 對差異表達基因通過DAVID及KEGG數(shù)據(jù)庫進行信號通路分析，以更深入地了解該基因的生物學功能。基于DAVID數(shù)據(jù)庫進行通路注釋，采用Fisher檢驗篩選差異基因富集的顯著性通路(P<0.05)。如圖3C所示，在對差異表達基因進行的富集功能分類中排名前10的信號通路分別為：甲型流感、單純皰疹感染、麻疹、C型肝炎、RIG-I樣受體信號、病毒致癌、乙型肝炎、Toll樣受體信號、胞質(zhì)DNA傳感和趨化因子信號轉(zhuǎn)導通路。

3 討 論

HEV感染會引起機體產(chǎn)生免疫應答，免疫應答是機體的重要防御機制，也是導致宿主細胞損傷繼而產(chǎn)生臨床癥狀的關鍵因素。戊型病毒性肝炎的臨床表現(xiàn)從自限性急性病毒性肝炎(AVH)至急性肝功能衰竭(ALF)，病理變化包括免疫細胞浸潤和肝細胞壞死、溶解。人類和動物的研究結(jié)果均表明，HEV對肝細胞無直接病變作用，肝細胞的損害并非病毒復制所致，而是由宿主免疫反應引起的宿主細胞損傷，病毒誘發(fā)的細胞免疫參與了戊型肝炎病毒感染的發(fā)病機制[8]。同時臨床上觀察到戊型肝炎急性期, 患者外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs)在受到ORF2抗原刺激時反應增強，CD4+T細胞數(shù)量升高，產(chǎn)生干擾素-γ (IFN-γ) 的量明顯高于對照，推斷CD4+T細胞，可能參與了戊型肝炎急性患者的肝細胞損傷；此外，臨床患者在出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高、黃疸等癥狀時，伴隨抗體上升和病毒載量下降等現(xiàn)象，也表明了肝細胞損傷與體液免疫和細胞免疫反應有關[9]。

本實驗通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對HEV感染前后HepG2細胞的差異表達基因進行分析，共篩選得到差異表達的基因132個，上調(diào)表達基因127個，下調(diào)表達基因5個。通過差異表達基因篩選、GO功能富集分析以及KEGG通路分析，篩選出幾個與抗病毒免疫相關的基因，與對照組相比，在HEV感染組表達顯著上調(diào)，這些基因可能與HEV感染相關，參與了宿主抗病毒過程，可作為候選基因，作為進一步深入研究的基礎。

3.1DDX58和IFIH1 (RIG-I和MDA5) DDX58基因編碼一種RNA解旋酶，與許多細胞過程有關，包括RNA結(jié)合和RNA二級結(jié)構(gòu)的改變。它參與病毒雙鏈RNA的識別和免疫應答的調(diào)節(jié)，相關通路為DDX58/IFIH1 (RIG-I/MDA5)誘導的IFN-α和IFN-β通路。IFIH1，是DDX58的旁系同源基因，與DDX58協(xié)同作用誘導I型干擾素產(chǎn)生，發(fā)揮抗病毒作用。IFIH1和DDX58與中國漢族人群的慢性丙型肝炎發(fā)生相關，是RNA病毒感染天然免疫應答的重要啟動子，可能在丙型肝炎病毒(HCV)感染結(jié)局中起重要作用[10]。結(jié)合本文的研究結(jié)果，猜測IFIH1和DDX58可能參與HEV感染過程。RIG-I樣受體(RLRs)DDX58和IFIH1是天然抗病毒反應的關鍵因子。一旦識別出病毒RNA，它們與MAVS相互作用，可能誘導產(chǎn)生I型干擾素[11]。DDX58、IFIH1和IFN調(diào)節(jié)因子1(IRF1)是抗HEV的關鍵基因，DDX58的基礎表達可抑制HEV感染天然配體5′-三磷酸核糖核酸對RIG-I途徑的激活可能抑制戊型肝炎病毒的復制，激活DDX58可刺激細胞通過IFN誘導的JAK-STAT級聯(lián)信號，產(chǎn)生對HEV的天然免疫[12]。

3.2STAT1和STAT2 STAT家族成員被受體相關激酶磷酸化，形成同源或異源二聚體，轉(zhuǎn)位到細胞核，作為轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮作用。 I型干擾素(IFN-α和IFN-β)與細胞表面受體結(jié)合后，通過蛋白激酶導致Jak 激酶(Tyk2和JAK1)活化，以及STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化，磷酸化的STATs二聚體化并與IRF-9 形成一個復合體，稱為ISGF3轉(zhuǎn)錄因子，進入細胞核。ISGF3結(jié)合干擾素刺激反應元件(ISRE)，激活干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄(ISG)，促進細胞進入抗病毒狀態(tài)。

3.3TLR3 戊型肝炎病毒感染誘導細胞免疫應答主要是通過病原體識別受體(PRRs)實現(xiàn)，包括維甲酸誘導基因I(RIG-I)樣受體和Toll樣受體(TLRs)[13-14]。TLRs在啟動固有抗病毒反應中發(fā)揮重要作用，識別病毒RNAs后，激活下游級聯(lián)信號，涉及各種信號分子，如線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)、干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)、IRF7和核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)[15-16]。TLRs的特異性配體刺激PBMCs，可以誘導I型干擾素的產(chǎn)生[17]。

I型干擾素，主要包括 IFN-α、IFN-β、 IFN-ε、IFN-κ、FN-ω和IFN-ν等[18-19]，是細胞內(nèi)抗病毒免疫的第一道防線。一旦細胞內(nèi)發(fā)生HEV感染，病毒基因組被病原體識別受體識別，導致細胞內(nèi)信號級聯(lián)快速激活。Ⅰ型干擾素的表達誘導一系列干擾素-刺激基因，幫助細胞對付病毒感染。在感染的細胞中，I型干擾素可直接對抗病毒的感染和復制，并激活其他免疫細胞，如自然殺傷細胞，樹突狀細胞和Kupffer細胞。在此次研究中，IFI6、IFITM1、IFIH1、IFNL1、IRF9、ISG20、IFI35及IFIT1等多種干擾素誘導蛋白、干擾素誘導跨膜蛋白、干擾素λ1、干擾素調(diào)節(jié)因子及干擾素刺激基因表達上調(diào)，說明HEV感染后，這些基因參與了抗病毒免疫。

TLR3是單次跨膜細胞表面受體，它識別與病毒感染有關的核酸RNA，介導有效免疫所需要的細胞因子的產(chǎn)生，是先天免疫與適應性免疫的關鍵組成部分。通過TRIF/TICAM1，誘導NF-κB的活化和I型干擾素的生產(chǎn)，刺激細胞因子分泌并促進炎癥反應。因此，TLR3可能在宿主防御病毒方面發(fā)揮作用。

TLR3和IFN-γ在戊型肝炎發(fā)病機制中起重要作用。能高水平表達TLR3和IFN-γ的患者能夠控制疾病和康復；而TLR3和IFN-γ低表達的患者傾向于發(fā)展為ALF[20]，與ALF患者相比，AVH患者的TLR3基因表達、抗炎和促炎細胞因子的含量均較高；IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β在PBMC培養(yǎng)上清液檢測中也較高。沉默TLR3后，在PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-γ的水平顯著降低[20]。在此次研究中，TLR3表達上調(diào)，說明HEV感染后，HEV的RNA會被細胞內(nèi)的模式識別受體中的TLR3識別，激活MyD88-非依賴途徑信號通路，激活IRF9，調(diào)節(jié)炎性細胞因子IFN-α及IFN-β的表達，產(chǎn)生抗病毒作用。

3.4CXCL8(IL-8)和CXCL10 CXCL8基因編碼的蛋白CXCL8是一種趨化因子，屬CXC趨化因子家族的成員，主要參與炎癥反應。炎癥反應中，CXCL8招募中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和T細胞到炎癥部位，發(fā)揮抗感染作用。CXCL10是抗菌基因編碼的趨化因子，也屬CXC家族成員，是受體CXCR3的配體。結(jié)合受體CXCR3后，可刺激單核細胞、自然殺傷細胞和T細胞遷移，調(diào)控粘附分子的表達。

NF-κB 作為炎癥反應的重要轉(zhuǎn)導通路，參與對免疫反應及炎癥反應的調(diào)控，包括介導機體對病原體入侵的天然免疫及適應性免疫應答，T、B細胞的發(fā)育、增殖及炎癥反應等生物過程。NF-κB 還可調(diào)控CXCL8的表達，在本次研究中，炎性細胞因子CXCL8表達上調(diào)，說明HEV感染后，NF-κB通路激活，促進CXCL8表達上調(diào)，促進機體免疫相關蛋白合成、生長抑制、樹突狀細胞及NK細胞活化、CTL細胞分化以及抗體產(chǎn)生，并最終造成感染細胞凋亡。

3.5EIF2AK2(PKR) 該基因編碼的蛋白質(zhì)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，結(jié)合dsRNA后可通過自磷酸化激活，活化后可以磷酸化翻譯起始因子(EIF2S1)，使其活化從而抑制蛋白質(zhì)的合成，在病毒感染的固有免疫反應中起著關鍵作用。EIF2AK2可選擇性調(diào)節(jié)免疫應答基因的轉(zhuǎn)錄[21]，也可通過磷酸化EIF2S1的α亞基，最終導致細胞和病毒蛋白質(zhì)的合成停止，抑制病毒的復制。作為一個銜接蛋白和/或通過其激酶活性，都可以調(diào)節(jié)多種信號通路(p38-MAP激酶，NF-kB和胰島素信號通路)和轉(zhuǎn)錄因子(JUN、STAT1、STAT3、IRF1，ATF3)，這些轉(zhuǎn)錄因子參與編碼促炎性細胞因子和干擾素的基因的表達。

3.6IRF-9 (ISGF3G) I型干擾素與細胞表面受體結(jié)合后，通過蛋白激酶作用導致Jak激酶(Tyk2和JAK1)活化，并使STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化。磷酸化的STATs二聚體化與IRF-9形成一個復合體，稱為ISGF3轉(zhuǎn)錄因子，進入細胞核。ISGF3結(jié)合干擾素刺激反應元件(ISRE)，激活干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞進入抗病毒狀態(tài)，發(fā)揮抗病毒效應。此外，IRF-9還可抑制細胞內(nèi)HEV RNA的復制[22]。與此次研究結(jié)果類似，在一項研究中，急性HEV感染患者的細胞中，IRF-9、STAT1、IFNα和TNFα等基因表達增加[23]，這些結(jié)果有助于了解HEV感染的潛在炎癥過程，后續(xù)研究將關注IRF-9 在抗病毒免疫中的作用。

本研究結(jié)合mRNA轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學方法，研究了HEV感染前后HepG2細胞的差異表達基因，篩選出可能參與抗病毒免疫的基因，為研究HEV感染提供了目標，也為進一步研究HEV感染的防御反應機制和理解宿主反應提供新的見解。

利益沖突：無