彭文軍，曹得萍，張耀剛，劉 燕，姜博璠，趙海龍

細粒棘球蚴病(囊型包蟲病)是細粒棘球絳蟲幼蟲(棘球蚴)寄生于人及食草類動物和嚙齒類動物組織器官而引起的一種嚴重的人獸共患寄生蟲病[1]。全國每年感染棘球蚴的家畜5 000 萬頭，造成近30億元的損失[2]。 細粒棘球蚴包囊可寄生在人體任何部位，以肝臟居多 (約占70%)，其次是肺(約占20%)，大腦、肌肉等其他部位約占10%[3]。細粒棘球絳蟲廣泛流行于青海省南部藏區(qū)，其棘球蚴對廣大農牧民的身體健康和南部地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展帶來嚴重影響[4-5]。前期研究[6-7]結果顯示人體棘球蚴原頭節(jié)、囊壁、囊液蛋白質表達有差異，而且棘球蚴和泡球蚴組織蛋白質表達也有差異。本研究利用iTRAQ和LC-MS/MS技術對綿羊肝臟及肺臟分離細粒棘球蚴原頭節(jié)(肝臟原頭節(jié)(hepatic protoscoleces, Hepatic_P)和肺臟原頭節(jié)(lung protoscoleces，Lung_P))進行蛋白質鑒定分析，尋找宿主不同寄生部位棘球蚴原頭節(jié)特異表達的蛋白質分子，為研究調控細粒棘球蚴生長發(fā)育、侵襲、轉移等過程蛋白質提供科學依據。研究同一宿主不同寄生部位棘球蚴原頭節(jié)蛋白質差異表達譜特征對進一步揭示其在同一宿主不同臟器寄生、增殖、分化、凋亡和轉移中的作用及其機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1實驗標本 收集西寧市牛羊屠宰場感染棘球蚴的綿羊肝臟和肺臟，在實驗室無菌狀態(tài)下分離棘球蚴囊壁、囊液、原頭節(jié)。原頭節(jié)用無菌生理鹽水漂洗3遍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2原頭節(jié)總蛋白質制備和SDS電泳 本實驗共收集4組肝臟和肺臟棘球蚴原頭節(jié)，每組原頭節(jié)樣品稱取0.05 g在液氮中將樣本研成粉末后轉至離心管中，加入裂解液(含1 mmol/L的PMSF、2 mmol/L的EDTA)混勻，置于冰上5 min后加入終濃度為10 mmol/L的DTT，冰浴超聲5 min；25 000 g 4 ℃離心20 min，取上清轉入新的離心管中，加入5倍體積冷丙酮沉淀過夜；25 000 g 4 ℃離心20 min，棄上清；加入1 mL冷丙酮，搗碎沉淀，置于-20 ℃ 30 min，25 000 g 4 ℃離心20 min，棄上清；風干沉淀中殘余丙酮，加入適量裂解液，搗碎沉淀，混勻冰浴超聲5 min；25 000 g 4 ℃離心15 min，取上清用于定量。Bradford法測定蛋白質濃度。每個樣品上樣量30 μg，Marker上樣量10 μg，進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.3蛋白質酶解 每個樣品取出100 μg，按蛋白質∶酶=20∶1的比例加入Trypsin，37 ℃酶解4 h。按上述比例再補加Trypsin 1次，37 ℃繼續(xù)酶解8 h。

1.4iTRAQ標記 胰蛋白酶消化蛋白質后，用真空離心泵抽干肽段；用0.5 mol/L TEAB復溶肽段，分別用8標iTRAQ 試劑中的 113、114、115、116、117、118、119和121等 4 個標記分子進行標記 (具體操作參照試劑盒說明書) 后等量混合。每一組肽段被不同的iTRAQ標簽標記，室溫培養(yǎng)2 h；將標記后的各組肽段混合，用SCX柱進行液相分離。

1.5基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MSMS分析 將抽干的每個組分分別用buffer A (5% ACN, 0.1% FA) 復溶至約0.5 μg/μL的濃度，20 000 g離心10 min，除去不溶物質。每個組分上樣5 μL(約2.5 μg蛋白)，通過島津公司LC-20AD型號的納升液相色譜儀進行分離。

1.6蛋白數據庫搜索 采用Mascot 2.3.02蛋白質鑒定軟件進行蛋白數據庫搜索。

2 結 果

2.1各樣本蛋白質提取濃度和提取量 提取的各組原頭節(jié)總蛋白質經Bradford定量，其原頭節(jié)蛋白質濃度及得到的總蛋白質量如表1所示，得到的各組蛋白質量滿足SDS-PAGE及ITRAQ蛋白分析的用量。

表1 肝臟和肺臟各樣本原頭節(jié)蛋白質濃度及提取量

2.2各樣本蛋白質SDS-PAGE電泳膠圖 各原頭節(jié)樣本總蛋白質行SES-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色后蛋白質表達譜如圖1所示，各樣本蛋白質條帶在35～45 kDa之間有差異，尤其是肝4的樣本大約在55 kDa處蛋白質濃度高。

M：蛋白質標記物；L-P表示肺臟原頭節(jié)；H-P表示肝臟原頭節(jié)；1、2、3、4表示第1組，第2組，第3組，第4組

2.3質譜檢測結果 標記好的肽段經 SCX 分離及 C18 除鹽后用 ESI-Q-TOF 質譜儀進行質譜分析，檢測方式：正離子，掃描范圍：50～3 000 m/z，利用 Mascot (http: //www.matrix science. com/search_form_select.html) 軟件對蛋白質進行定性及定量分析，通過實驗中所得到的質譜數據與生物信息學數據庫比對得到蛋白質定性及定量結果，共獲得與棘球絳蟲匹配的肽段1 229個，其中2段以上不同肽段覆蓋的蛋白266個，占全部鑒定蛋白的93.99%；5段以上不同肽段覆蓋蛋白179個，占全部鑒定蛋白的63.25%；10段以上不同肽段覆蓋的蛋白86個，占全部鑒定蛋白的30.39%，蛋白分離和鑒定結果均較好。這一結果表明采用iTRAQ試劑標記結合液相色譜串聯(lián)質譜技術可以實現(xiàn)對寄生于青海省青南地區(qū)綿羊肝臟和肺臟細粒棘球絳蟲棘球蚴原頭節(jié)蛋白質組的有效分離和鑒定，圖2為每組寄生于肝臟與肺臟原頭節(jié)的差異蛋白質數量。

(紅色代表上調，綠色代表下調)

2.4生物信息學分析及功能注釋 實驗所得質譜數據wiff文件通過ProteinPilot 3.0軟件檢索SwissProt數據庫 (090303.fasta)，種屬選擇為sheep。使用Cluster3.0軟件進行分層聚類分析蛋白的表達模式。本研究運用集分析算法對初步鑒定的1 159個蛋白質數據進行分組，鑒定的蛋白質與數據庫進行比對，選擇GO的生物過程、細胞成分和分子功能注釋對蛋白質進行分類、注釋。參與免疫系統(tǒng)的蛋白質有141個，參與代謝的蛋白質有441個，參與信號轉導的蛋白質有180個，還有一些蛋白質參與物質轉運、細胞周期等，部分差異表達的蛋白質如表2所示。

2.5蛋白質功能聚類分析 通過GO注釋對蛋白功能進行聚類分析，通過對寄生在綿羊肝臟和肺臟細粒棘球絳蟲原頭節(jié)差異蛋白進行KEGG通路和GO分析對參與各類生物過程的1 229個蛋白質進行富集度分析，結果顯示代謝相關蛋白質以及應激反應、細胞骨架合成、基因表達翻譯和發(fā)育相關的蛋白質在原頭節(jié)中顯著富集(圖3)，這些蛋白質歸屬于5個生物過程，分別是：生物系統(tǒng)、新陳代謝、遺傳信息過程、環(huán)境信息過程和細胞系統(tǒng) (圖4)。

表2 部分綿羊肝臟及肺臟細粒棘球蚴原頭節(jié)顯著差異表達的蛋白質

圖3 顯示差異蛋白質GO富集蛋白質分布圖

圖4 蛋白質KOG功能分類

3 討 論

蛋白質在細胞中有多種功能，它是細胞信號傳導、形態(tài)結構維持、胞內物質代謝等生理功能的執(zhí)行者，搞清楚包蟲囊形成機制為包蟲病的防治帶來指導性作用。細粒棘球絳蟲蟲卵進入中間宿主后發(fā)育形成囊的過程是一個復雜的過程[8]，棘球蚴囊的形成過程：蟲卵-六鉤蚴-棘球蚴囊，六鉤蚴到底是怎么空泡化發(fā)育為囊泡，再形成由外向內的角皮層、生發(fā)層及囊內含物這是一個關鍵問題，此過程中必定有眾多的蛋白質參與包蟲囊形成過程，也有蛋白質參與了寄生蟲的免疫逃避等生物過程[9]。

付世強等[10]分析綿羊肝臟、肺臟細粒棘球蚴原頭節(jié)miRNA表達特征時發(fā)現(xiàn)在綿羊肝臟和肺臟分別有94條和88條miRNA 特異表達，這些特異表達的miRNA可能與棘球蚴的寄生部位不同有關。既然發(fā)現(xiàn)不同部位寄生原頭節(jié)表達的基因有差異，那么可以推測基因表達的蛋白質表達也會有差異。Cui SJ等[11]運用2D和LC-MS技術在綿羊肝臟細粒棘球絳蟲原頭節(jié)以及犬小腸內成蟲共鑒定出1 610個蛋白質，大部分是綁定蛋白和具有催化活性的蛋白質，390個來自綿羊原頭節(jié)蛋白質中至少有339個是新鑒定的。本研究運用SDS-PAGE確定差異蛋白質大約分布在35～55 kDa范圍之間，利用iTRAQ和LC-MS/MS技術對肝臟原頭節(jié)與肺臟原頭節(jié)的蛋白質進行ITRAQ蛋白質組比較分析共分離鑒定出1 229個蛋白質，發(fā)現(xiàn)了217個差異蛋白質，74個蛋白質表達在肝臟原頭節(jié)中上調，143個蛋白質表達在肝臟原頭節(jié)中下調，還發(fā)現(xiàn)了多個未鑒定的新蛋白質，推測可能是原頭節(jié)在不同部位寄生時所處的環(huán)境不同導致其蛋白質表達發(fā)生不同。

本研究只是得到了綿羊肝、肺組織中棘球蚴原頭節(jié)蛋白質表達譜，但靶蛋白的調控及靶蛋白與免疫應答及蟲體的發(fā)育機制仍需進一步明確。本研究中發(fā)現(xiàn)鐵蛋白是一個有意義的下調差異蛋白質(蛋白質質量：24.5 kDa，有5個獨特肽，肝肺比值：0.35)，且眾多研究表明如肝癌[12]、脂肪肝[13]、肝炎[14]等肝臟疾病與鐵蛋白表達異常緊密相關，并且由于鐵蛋白獨特的結構和特性，其已成為藥物治療的研究熱點之一。棘球蚴寄生在肝臟引起的肝包蟲病也是一種肝臟疾病，故研究鐵蛋白的功能及其在肝棘球蚴病中的作用機制，對預防和治療肝包蟲病有著極其重要的意義。后續(xù)研究將從鐵蛋白與棘球蚴的生長發(fā)育關系、鈣離子代謝、纖維化等方面進行，希望能夠發(fā)現(xiàn)細粒棘球蚴原頭節(jié)在綿羊肝臟和肺臟生長發(fā)育與鐵蛋白的相關性，為動物中間宿主包蟲病的分子防治提供實驗依據和思路。

利益沖突：無