李寶林，袁 蘭，葉 婷，田 剛，曾章銳，蔡宛玲，羅思劍，劉靳波

2019 年12月在中國湖北省武漢市首次報道有新型冠狀病毒感染的肺炎病例，此后在其他省份相繼有報告類似病例[1-2]。2020年2月11日國際病毒分類委員會將新型冠狀病毒正式命名為SARS-CoV-2，2020年2月22日，國家衛(wèi)健委正式將新型冠狀病毒肺炎英文名稱修訂為COVID-19[3]。在最新的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[4]中闡述病例診斷需具備病原學特征之一：1)實時熒光RT-PCR檢測SARS-CoV-2 核酸陽性；2)病毒基因測序，與已知的 SARS-CoV-2 高度同源。因此準確、及時的病原學核酸檢測已成為診斷 SARS-CoV-2感染的重要環(huán)節(jié)。同時在第六版方案鑒別診斷中指出：新型冠狀病毒感染輕型表現(xiàn)需與其它病毒引起的上呼吸道感染相鑒別；新型冠狀病毒肺炎主要與流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他已知病毒性肺炎及肺炎支原體感染鑒別。強調(diào)“對疑似病例要盡可能采取包括快速抗原檢測和多重PCR核酸檢測等方法，對常見呼吸道病原體進行檢測”。

引起發(fā)熱、咳嗽等上呼吸道癥狀，又能感染下呼吸道引起肺炎，類似SARS-CoV-2感染的病原體有多種，如SARS冠狀病毒[1]。SARS-CoV-2病毒更容易傳播，潛伏期更長[5]，這給臨床診斷帶來很大困難，及時有效的鑒別出患者病原體感染，在疫情防控中將起到重要作用。本研究對西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院114例COVID-19疑似患者咽拭子標本進行回顧分析，檢測患者是否有其它呼吸道病毒感染。

1 材料與方法

1.1標本來源 2020年2月1日至2020年2月12日，收集西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院114例新冠疑似患者咽拭子標本，114例門診患者均有發(fā)熱、咳嗽等上呼吸道癥狀，部分患者有下呼吸道癥狀。男性55例，女性59例，年齡最小出生16 d，最大80歲。

1.2試劑與儀器 半自動核酸提取儀EX3600及配套核酸提取試劑(批號：P20200203)購自上海之江生物科技股份有限公司。SARS-CoV-2核酸擴增試劑由湖南圣湘生物科技股份有限公司(批號：2020004)和上海之江生物科技股份有限公司(批號：P20200203)提供。SARS-CoV-2核酸擴增設備ABI7500熒光定量PCR儀購自美國Thermofisher公司。呼吸道病毒核酸檢測試劑盒及配套核酸檢測設備加熱離心機、RTisochipTM-A微流控芯片核酸分析儀購自成都博奧晶芯生物科技有限公司。

1.3標本的采集與處理 咽拭子標本采集按照國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第四版)》進行采集[6]，將收到的標本置于56 ℃烤箱中30 min進行滅活處理，滅活后標本管在振蕩器振蕩不低于2 min。核酸的提取：取1 000 μL標本洗脫液13 000 r/min離心10 min，棄部分上清，留取300 μL上清液與沉淀混勻，將混合物吸入EX3600核酸提取儀預裝板A孔中，將預裝板置于設備固定位置，啟動核酸提取程序提取核酸，洗脫體積70 μL。

1.4SARS-CoV-2核酸的擴增 SARS-CoV-2核酸擴增引物及探針均由湖南圣湘提供，有2個靶序列。FAM區(qū)域靶標(ORF 1ab)：ROX區(qū)域靶標(N基因)：內(nèi)標通道VIC檢測人體細胞核糖核酸酶P(Ribonuclease P，RNase P)，所有檢測標本核酸同時再用上海之江SARS-CoV-2擴增試劑擴增驗證ORF 1ab和N基因，所有操作均按照試劑說明書操作。核酸確診陽性根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第四版)》要求進行判讀。

1.5呼吸道病毒核酸擴增 按照博奧呼吸道病毒核酸檢測試劑盒說明書操作，呼吸道病毒核酸擴增結(jié)果判讀：結(jié)果由軟件自動分析，出現(xiàn)S型曲線且Tp(Time postive)值≤35，則判斷為陽性。出現(xiàn)S型曲線且Tp值>35，報告為疑似陽性。當無S型曲線且Tp值顯示為“-”，則判斷為陰性。Tp值定義：“S”型曲線進入快速擴增期的第1個拐點，拐點對應的時刻與原點時刻的差值定義為Tp值，單位為min。呼吸道病毒核酸檢測指標有：甲型流感病毒2009 H1亞型、甲型流感病毒季節(jié)性 H1亞型、甲型流感病毒季節(jié)性 H3亞型、甲型流感病毒 H7亞型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腸道病毒/鼻病毒、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、柯薩奇病毒A6型、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、人副流感病毒4型、人偏肺病毒、冠狀病毒OC43/HKU1型、冠狀病毒NL63/229E型。

2 結(jié) 果

2.1COVID-19疑似患者SARS-CoV-2核酸擴擴增曲線 采用2種試劑平行對114例COVID-19疑似患者進行SARS-CoV-2核酸擴增，擴增結(jié)果均為陰性。部分患者內(nèi)標基因擴增曲線見圖1，圖1A是由湖南圣湘檢測試劑進行擴增，內(nèi)標Ct值集中在20～25之間，圖1B是由上海之江檢測試劑進行擴增，內(nèi)標Ct值集中在28～31之間。

圖1 SARS-CoV-2核酸擴增內(nèi)標基因擴增曲線

2.2114例COVID-19疑似患者18種呼吸道病毒核酸檢測 114例COVID-19疑似患者中，有21例查出非SARS-CoV-2感染的呼吸道病毒，感染率達18.42%，≤20歲有8例，≤40歲有7例，≤60歲有6例。同時感染兩種病毒的有3例：病例15混合感染了呼吸道合胞病毒和柯薩奇病毒A16型，病例45混合感染了冠狀病毒NL63/229型和人副流感病毒1型，病例74混合感染了甲型流感病毒和甲型流感病毒季節(jié)性H3亞型。21例患者中，感染乙型流感病毒有6例，感染呼吸道合胞病毒有5例，感染冠狀病毒NL63/229型和腸道病毒/鼻病毒各有3例，感染人偏肺病毒有2例，詳見表1。

表1 21例COVID-19疑似患者呼吸道病毒病毒感染分析

2.310種呼吸道病毒恒溫擴增曲線及Tp值 21例呼吸道病毒感染患者中，共有10種病毒感染，病毒恒溫曲線見圖2，其中A代表的是乙型流感病毒。PC(Positive external control)外對照，芯片中預包埋的陽性對照品，檢測整個恒溫擴增過程是否存在抑制物。IC(Internal control)內(nèi)對照，擴增樣本中的管家基因GAPDH，檢測整個采樣和提取過程是否合格。圖2中的PC和IC擴增都很明顯，說明整個實驗是成功的。各病例病毒擴增Tp值見表1。

圖2 呼吸道病毒恒溫擴增曲線圖

3 討 論

2020年1月7日，研究人員從一名武漢患者體內(nèi)成功分離出SARS-CoV-2病毒并進行了全基因組測序[7-8]，研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2是冠狀病毒的一種，其中有2種冠狀病毒，嚴重急性呼吸綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合癥冠狀病毒(MERS-CoV)已經(jīng)在世界范圍內(nèi)引起了了嚴重急性呼吸道疾病的暴發(fā)[9]。SARS-CoV-2發(fā)病時常見臨床癥狀有發(fā)熱、干咳、肌肉疼痛，這些癥狀和SARS-CoV、MERS-CoV很像，因此，快速準確的臨床診斷成為控制疫情的關鍵，但是面對未知病毒的感染，快速對其進行鑒別診斷、排除其它病毒感染、進行多種病原體檢測同樣顯得重要，在不同版本的《新型冠狀病毒感染的肺炎治療方案》中也多次提出。Chen等[10]研究了99例COVID-19感染患者，發(fā)現(xiàn)1例(1%)合并細菌感染，4例(4%)合并真菌感染，汪明等[11]對武漢地區(qū)8 274例新型冠狀病毒核酸受檢者同時進行13種常見呼吸道病原體多重PCR檢測，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2陽性患者會合并感染其他病原體。以上都說明，在防控COVID-19疫情時必須把其它病原體納入檢測計劃中。本研究將114例COVID-19疑似患者做為研究對象，采用恒溫擴增法對其咽拭子標本進行了18種呼吸道病毒檢測的回顧性分析，該技術能夠快速精準的檢測MERS-CoV的ORF基因和N基因，效果優(yōu)于實時定量RT-PCR[12-13]。通過篩查發(fā)現(xiàn)18.42%的SARS-CoV-2核酸陰性患者有呼吸道病毒感染。包括5例嬰幼兒和1例兒童，6例患者均感染了不同的呼吸道病毒，這與李權恒等[14]研究有一定出入，也更加說明了呼吸道感染的復雜性。而在所有感染的患者中，從0歲到60歲均有人群感染不同的呼吸道病毒，沒有明顯年齡易感趨勢，這和SARS-CoV-2感染很相似，因此在整個疫情防控中一定要做好呼吸道病毒感染的鑒別。

利益沖突：無