梁志森 陳玉珍 周朗君

(1. 廣州檢驗檢測認證集團有限公司，廣東 廣州 511447；2. 國家加工食品質(zhì)量檢驗中心﹝廣東﹞，廣東 廣州 511447)

茶葉是世界上主要的無酒精飲品之一。茶葉的風味是評價茶葉質(zhì)量和影響其售價的重要因素[1-2]，因此人們常擔心不法商家往劣質(zhì)茶葉中非法添加香料以改善茶葉的香氣香型，以次充好、牟取暴利。香豆素是豆香型主要香料之一，對小鼠胚胎有毒性，對大鼠可能會誘發(fā)癌癥、中毒等不良反應[3-4]，有研究[5-6]表明在綠茶中檢出低含量的香豆素。胡椒酚甲醚是藿香、小茴香、茴香等植物的主要香氣成分[7]，可用于無酒精飲料的調(diào)味，但具有一定的基因毒性和致癌性[8]。茴香烯具有八角茴香樣味，屬于茶花屬花香氣成分[9]，是重要的食品香料，按成年人體重計每日可接受攝入量為0.0～2.0 mg/kg[10-11]。有研究[12-13]指出，攝入高劑量的茴香烯會對大鼠干細胞、人類精子功能產(chǎn)生不良影響。指甲花醌具有桂花香氣，廣泛用作海娜染發(fā)劑[14]，高劑量攝入可以引起小鼠溶血性貧血和腎小管壞死[15-16]，在化妝品和食品中均被禁止添加。反式肉桂醛是重要的香料和食品添加劑，具有肉桂香味，有研究[17]指出其對人體是一種敏化劑，毒性較低。

中國GB 2760—2014規(guī)定茶葉中不允許添加香料，但未規(guī)定檢測方法。根據(jù)美國《聯(lián)邦規(guī)章典集》[18](CFR)的189.180節(jié)，香豆素不能直接添加到食品中。歐盟的法規(guī)[19]嚴格限制如香豆素、蒲勒酮等香料在食品中的使用，并規(guī)定胡椒酚甲醚、甲基丁香酚在非酒精飲料中的最大允許使用限值分別為10，1 mg/kg。

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法[20-23]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[24-25]被廣泛地應用于食品中農(nóng)藥殘留、污染物、禁用物質(zhì)等的檢測。Bousova等[26]使用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合固相頂空微萃取法，建立了檢測食品中7種香料的方法，但未研究不同的茶葉基質(zhì)且未覆蓋茴香烯、反式肉桂醛和指甲花醌等物質(zhì)。Lopez等[21]使用氣相色譜—質(zhì)譜的方法，檢測了4類不同食品基質(zhì)中14種香料物質(zhì)，分析時間長達25 min，且該試驗未覆蓋綠茶、紅茶等茶葉基質(zhì)，此外，該方法對茴香烯的回收率僅有53%，難以滿足實際檢測的需求。

使用有機溶劑對茶葉中香料進行直接提取是一種簡便有效的方法。使用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)，可以對茶葉中非法添加的香料進行快速定性、定量分析。試驗擬基于UHPLC-MS/MS系統(tǒng)建立同時檢測茶葉中7種可能非法添加香料(香豆素、胡椒酚甲醚、指甲花醌、甲基丁香酚、蒲勒酮、茴香烯和反式肉桂醛)的定性、定量方法，以期提高檢測效率，節(jié)約成本，為政府監(jiān)管部門及檢測行業(yè)提供有效的分析技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲勒酮、茴香烯、反式肉桂醛標準品：純度>99%，中國上海源葉生物科技公司；

香豆素標準品、指甲花醌標準品：純度>99.5%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

胡椒酚甲醚標準品、甲基丁香酚標準品：純度>99.5%，中國上海安譜實驗科技股份公司；

十八烷基鍵合硅膠(C18)吸附劑(120～400目)和N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑(40～60 mm)：上海安譜科學儀器有限公司；

無水硫酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

乙醇、乙腈、甲酸：色譜純，德國Merck公司；

其他試劑均為分析純；

Kinetex C18柱(100 mm×3.0 mm，2.6 μm)：美國菲羅門公司；

試驗用水：超純水，美國Millipore超純水儀制備；

茶葉(綠茶和紅茶各50份)：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀：1290 Infinity II型，安美國捷倫科技公司；

三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：API 5500型，配電噴霧離子源(ESI)，美國AB SCIEX公司；

超純水系統(tǒng)：Mill-Q Gradient型，美國密理博公司；

快速均勻器：MS3型，德國IKA公司；

混合研磨儀：GM200型，德國Restch公司；

高速離心機：3K15型，德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制 分別取(20.0±0.1) mg的茴香烯、香豆素、胡椒酚甲醚、指甲花醌、甲基丁香酚、蒲勒酮和反式肉桂醛的標準品，分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈配制成2 000 mg/L的標準儲備液，并轉(zhuǎn)移至棕色瓶中。分別移取上述7種目標物的標準儲備液1 mL至10 mL 容量瓶中，配制成200 mg/L的混合標準儲備液。取混合標準儲備液，用0.1%甲酸乙腈溶液逐級稀釋成濃度為0.8，1.0，2.0，40.0，160.0，400.0，800.0，1 200.0，1 600.0 μg/L 的混合標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。所有標準儲備液均于4 ℃下保存。

1.3.2 樣品提取、稀釋、凈化 茶葉樣品經(jīng)過充分粉碎、均勻后，過篩(300 μm)，分別獨立儲存于樣品袋中，并于4 ℃ 下保存。稱取均勻后的茶葉樣品1.00 g于玻璃比色管中，加入乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)提取溶劑并定容至10 mL，渦旋2 min(3 000 r/min)，取1 mL上清液于15 mL 離心管中，并使用乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)稀釋至5 mL。于稀釋后溶液中加入5 mg PSA吸附劑、5 mg C18吸附劑和20 mg 無水硫酸鈉，渦旋振蕩2 min(3 000 r/min)，8 000 r/min離心2 min，取上清液過0.22 μm 有機微孔濾膜置于棕色進樣瓶，待測。

1.3.3 前處理條件優(yōu)化 分別對樣品前處理中提取溶劑種類、提取溶劑用量、凈化劑種類、凈化劑總用量、無水硫酸鈉用量進行優(yōu)化，其余步驟按照1.3.2操作。

1.3.4 質(zhì)譜條件 離子源ESI，正離子掃描；氣簾氣1.38×105Pa；霧化氣(GS1) 3.45×105Pa；輔助加熱氣(GS2) 4.83×105Pa；碰撞氣(CAD) 4.83×104Pa；電噴霧電壓(IS) 5 500 V；離子源溫度(TEM) 400 ℃；在電噴霧正模式下，分別對7種目標物各個碎片進行參數(shù)采集，選擇響應強度較高的兩對碎片離子作為依據(jù)，其中響應最高的子離子作為定量離子對，通過多反應檢測MRM模式優(yōu)化各個碎片離子的去簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)。

1.3.5 色譜條件 色譜柱為Kinetex C18柱(100 mm×3.0 mm，2.6 μm)。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～2 min，10% B～90% B；2～4 min，90% B；4～6 min，10% B。流速0.4 mL/min，柱溫20 ℃，進樣量10 μL。

1.3.6 基質(zhì)標準曲線的制備 分別稱取不含目標物的空白茶葉樣品1.00 g，按1.3.1的方法進行處理。用基質(zhì)提取液稀釋標準溶液，以峰面積(Y)為縱坐標對各被測組分的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標作圖，繪制基質(zhì)標準曲線。

1.3.7 回收率的計算 按照1.3.2的方法稱取均勻后的茶葉樣品，在樣品中添加30 mg/kg混合標準溶液，進行加標回收試驗，每個添加水平平行測定6次計算平均回收率。

1.3.8 精密度的計算 按照1.3.7的方法進行加標回收試驗后，在同一天內(nèi)進行6次平行測定日內(nèi)精密度試驗，連續(xù)3 d內(nèi)進行平行測定6次日間精密度試驗。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 測量數(shù)據(jù)采用Analyst 1.61進行采集和處理，使用Origin 8.0進行科學作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑種類的優(yōu)化 茶湯一般使用水作為溶劑，而乙腈和乙醇是超高效液相色譜常用的提取溶劑?？紤]到指甲花醌、反式肉桂醛較易溶于水，而蒲勒酮、香豆素、茴香烯等物質(zhì)難溶于水。為了實現(xiàn)7種目標物的高效提取，以空白茶葉為基質(zhì)在20 mg/kg的加標水平下，考察了乙腈、乙腈—水(V乙腈∶V水=4∶1)、乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)、乙醇—水(V乙醇∶V水=4∶1)、乙醇—水(V乙醇∶V水=1∶1)、乙醇和水7種提取溶劑對7種目標物的提取效率，結(jié)果如圖1所示。當使用乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)為提取溶劑時，7種目標物的回收率均在75.2%～85.6%，基本滿足試驗的要求。當使用純乙腈、乙腈—水(V乙腈∶V水=4∶1)為提取溶劑時，胡椒酚甲醚和指甲花醌的平均回收率分別為56.2%和65.6%，而茴香烯的平均回收率達到114%，顯然不能滿足7種目標物同時提取的要求。當使用其他提取溶劑時，7種目標物的平均回收率均比使用乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)時低。因此，最終選擇乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)為最佳提取溶劑。

2.1.2 提取溶劑用量的優(yōu)化 根據(jù)2.1.1的試驗結(jié)果，以乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)為提取溶劑，考察2.5，5.0，10.0，25.0，50.0 mL不同提取溶劑體積對7種目標物回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。當提取體積為2.5 mL和5.0 mL 時，香豆素和反式肉桂醛的平均回收率分別高達111.5%和97.2%，而茴香烯、胡椒酚甲醚以及指甲花醌等物質(zhì)的平均回收率均低于56.0%。當提取體積為10.0 mL 時，7種目標物的平均回收率較穩(wěn)定，處于74.5%～84.4%，符合方法學的要求。當提取體積為25.0 mL 和50.0 mL時，茴香烯、胡椒酚甲醚和甲基丁香酚的平均回收率逐漸變低。因此，最終選擇10.0 mL為提取溶劑的體積。

圖1 提取溶劑種類與7種目標物回收率的關(guān)系

圖2 提取溶劑體積與7種目標物回收率的關(guān)系

2.1.3 凈化劑種類的優(yōu)化 茶葉的基質(zhì)復雜，試驗將C18和PSA組合作為凈化劑，以去除茶葉基質(zhì)中多酚、脂類、色素等干擾物。在凈化劑總質(zhì)量為10 mg、無水硫酸鈉用量為10 mg時，考察了5種不同比例的C18和PSA組合(mC18∶mPSA分別為1∶4，2∶3，1∶1，3∶2，4∶1)對7種目標物回收率的影響，結(jié)果如圖3所示。當mC18∶mPSA=1∶4時，茴香烯、指甲花醌和甲基丁香酚的平均回收率均低于68.0%，當mC18∶mPSA=3∶2或4∶1時，蒲勒酮的平均回收率分別達到103.2%和115.0%，但是指甲花醌的回收率均低于62.0%。當mC18∶mPSA=2∶3時，茴香烯的平均回收率為68.0%，低于70.0%的回收率要求。僅當mC18∶mPSA=1∶1時，7種目標物的平均回收率達到76.3%～85.5%，滿足方法學的要求，且回收率更穩(wěn)定。因此，選用凈化劑的組合比例為mC18∶mPSA=1∶1。

2.1.4 凈化劑總用量的優(yōu)化 在無水硫酸鈉用量為10 mg 時，凈化劑的組合比例為mC18∶mPSA=1∶1，考察5個不同凈化劑總用量(5，10，20，30，40 mg)對7種目標物回收率的影響，結(jié)果如圖4所示。當凈化劑總用量為5 mg 時，茴香烯、指甲花醌的平均回收率分別為46.8%和56.2%，不能滿足試驗要求。當凈化劑總用量為30 mg和40 mg時，7種目標物的回收率差異較大，其中茴香烯、指甲花醌的回收率均低于65.0%，仍不能滿足試驗要求。當凈化劑總用量為10 mg時，7種目標物的平均回收率為75.5%～85.4%，而當凈化劑總用量為20 mg時，7種目標物的平均回收率較高且比較穩(wěn)定，在80.5%～95.5%范圍內(nèi)，均符合方法學的要求，因此凈化劑的用量確定為20 mg。

圖3 凈化劑種類與7種目標物回收率的關(guān)系

2.1.5 無水硫酸鈉用量的優(yōu)化 無水硫酸鈉作為吸水劑和鹽析劑，能吸附水溶性干擾物，又能增強液液萃取中兩相的分離程度，有利于目標物的提取。試驗考察無水硫酸鈉的用量(5，10，20，30，40 mg)對7種目標物回收率的影響。結(jié)果顯示，當無水硫酸鈉的用量為5 mg時，指甲花醌的平均回收率僅為60.2%，不能滿足提取的要求。當無水硫酸鈉用量為10 mg和20 mg時，目標物均能獲得較高的回收率，分別為79.5%～95.0%和89.4%～100.4%，當無水硫酸鈉的用量增多時，7種目標物的平均回收率逐步下降。因此，最終確定無水硫酸鈉用量為20 mg。

圖4 凈化劑總用量與7種目標物回收率的關(guān)系

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 試驗7種目標物的單獨標準溶液分別通過針泵注射進入質(zhì)譜，在電噴霧正模式下，分別對7種目標物的各個碎片進行參數(shù)采集，選擇信號強度高的兩個碎片離子作為定性依據(jù)，其中信號最強的一對碎片離子作為定量離子對，并通過MRM模式優(yōu)化各個碎片離子的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)，具體見表1。

表1 7種分析物的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)表?

2.2.2 色譜條件的優(yōu)化 為保證色譜峰峰型尖銳以及較好的分離效果，探索了不同的流動相組成和比例，最終選用0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液作為流動相，使用優(yōu)化后的條件僅6 min內(nèi)就能實現(xiàn)7種目標物的全部出峰，且滿足基線分離，試驗譜圖見圖5。

2.3 方法的驗證

2.3.1 基質(zhì)效應的考察 由于茶葉基質(zhì)復雜，含有脂肪、色素、酚類等可能干擾檢測結(jié)果的物質(zhì)，因此需要對基質(zhì)效應進行考察。用1.3.2的前處理方法對樣品進行處理，得到基質(zhì)溶液，并以此基質(zhì)溶液按照1.3.6的方法配制標準工作曲線得到基質(zhì)匹配曲線，同時按照1.3.1的方法用0.1%甲酸乙腈溶液配制溶劑并繪制標準曲線。以7種目標物的基質(zhì)曲線的斜率與純?nèi)軇┣€斜率之比來確定基質(zhì)效應(ME)，當ME的絕對值>50%時，說明基質(zhì)效應明顯。正值代表基質(zhì)增強作用，負值代表基質(zhì)減弱作用。如表2所示，對于綠茶基質(zhì)，ME數(shù)值在74.7%～105.9%；對于紅茶基質(zhì)，ME數(shù)值在-5.2%～-84.1%。結(jié)果表明，對于綠茶基質(zhì)，7種目標物都存在明顯的基質(zhì)效應；對于紅茶基質(zhì)，茴香烯和胡椒酚甲醚的基質(zhì)效應明顯，因此進行定量分析時需要使用基質(zhì)匹配曲線進行校正。

1. 指甲花醌 2. 香豆素 3. 反式肉桂醛 4. 甲基丁香酚 5. 蒲勒酮 6. 茴香烯 7. 胡椒酚甲醚

ME=[(Kmat/Kstd)-1]×100%，

(1)

式中：

ME——基質(zhì)效應，%；

Kmat——基質(zhì)匹配曲線的斜率；

Kstd——標準曲線的斜率。

2.3.2 線性范圍、檢出限、定量限、回收率和精密度 按照1.3.6的方法配制7種目標物的基質(zhì)標準溶液(0.8～1 600.0 μg/L)，繪制工作曲線，得到相應的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1～0.999 9(見表2)，表明7種目標物在濃度范圍內(nèi)呈良好的線性。試驗以外標法進行定量，以3倍信噪比(S/N)響應時所對應的質(zhì)量濃度作為檢出限(LOD)，以10倍信噪比對應的質(zhì)量濃度作為定量限(LOQ)。方法的檢出限范圍為0.02～0.03 mg/kg，定量限范圍為0.06～0.10 mg/kg，具體見表2。在空白綠茶和空白紅茶樣品中添加3個不同濃度水平的混合標準溶液進行加標回收試驗，每個添加水平平行測定6次計算平均回收率。日內(nèi)、日間精密度試驗在同一天和連續(xù)3 d內(nèi)分別進行平行測定6次。試驗結(jié)果顯示，不同茶葉基質(zhì)中所有目標物的平均回收率為82.5%～102.5%；日內(nèi)、日間精密度分別小于16%和18%(相對標準偏差)。具體結(jié)果見表3。

表2 0.8～1 600.0 μg/L 濃度范圍內(nèi)茶葉基質(zhì)中方法的標準曲線、R2、基質(zhì)效應、檢出限和定量限

表3 不同茶葉基質(zhì)樣品中7種待測物的回收率、日內(nèi)和日間精密度

2.3.3 實際樣品檢測 應用該法對100個茶葉樣品(其中紅茶50個，綠茶50個)進行檢測，結(jié)果如表4所示。其中，茴香烯、香豆素和胡椒酚甲醚在實際樣品中有檢出，在綠茶樣品中其檢出的最高濃度分別為65.0，2.4，72.2 mg/kg；在紅茶樣品中其檢出的最高濃度分別為18.1，1.0，65.0 mg/kg，而其他5種物質(zhì)均未檢出，具體結(jié)果見表4。說明市售茶葉中存在非法添加香料的情況。

表4 不同茶葉樣品中分析物的濃度?

3 結(jié)論

利用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，建立了茶葉中7種可能非法添加的香料的快速檢測方法，優(yōu)化了前處理和儀器條件，并考察了不同的茶葉基質(zhì)效應。方法學評價和實際樣品檢測結(jié)果表明，該方法靈敏度高，操作簡便，分析時間短，能同時對7種目標物進行準確的定性定量分析，目標物回收率較高且穩(wěn)定。在市售100個茶葉樣品中檢測出茴香烯、香豆素和胡椒酚甲醚等非法添加香料，準確反映了市售茶葉中非法添加香料的實際情況，滿足實際監(jiān)管的要求。