鄭藝欣 郭澤鑌,3 張 怡,3鄭寶東,3 曾紹校,3 曾紅亮,3

(1. 福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2. 福建省特種淀粉品質科學與加工技術重點實驗室，福建 福州 350002；3. 中愛國際合作食品物質學與結構設計研究中心，福建 福州 350002)

蓮子(lotus seed)又名水芝丹，屬睡蓮科蓮屬，主要分布在福建、浙江、湖南、湖北、江西等地，是中國水生蔬菜栽培中的特種宿根經濟植物。蓮子作為一種高級滋補食品，對人體延緩衰老、降低血糖和提高免疫力等有著良好的促進作用[1]。蓮子淀粉是蓮子中的主要成分，在高溫條件下具有易糊化，易返生等特點，嚴重制約了蓮子淀粉產品的深加工應用和發(fā)展[2]。

普魯蘭酶脫支處理是功能性食品改性中的常用手段，其功能體現(xiàn)在能最大限度地水解淀粉質中α-1,6糖苷鍵的分支及鏈結構，以期產生更多的直鏈淀粉單螺旋體溶于體系，為進一步的深加工制備提供充分條件[3]。但有研究[4]指出單一的普魯蘭酶預改性對淀粉顆粒的脫支存在局限性，其主要歸咎于天然淀粉結構的包閉性，使酶難以進入淀粉螺旋空腔內而被截留于顆粒表面。由此，Reddy等[5]提出利用壓熱法和普魯蘭酶相結合的方法對淀粉進行預改性，結果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合預改性條件下的淀粉質溶液，其直鏈淀粉含量有顯著的提升，并通過提高淀粉—脂質復合物的包合率，有效改善了淀粉質的理化特性。但目前關于非熱處理與酶法的聯(lián)合預改性的相關研究卻鮮有報道。

高壓微射流納米均質技術是一種新興的非熱處理手段，具有短時高效的動態(tài)壓力處理能力，被認為是淀粉改性過程中最安全且高效的方法[6]。在處理過程中，高壓液流在通過均質閥微小的間隙時會產生強烈的剪切、撞擊和空穴效應，能在短時間內破壞連接淀粉鏈的共價鍵并打斷支鏈淀粉簇分支結構，并在一定程度上協(xié)同淀粉改性。

試驗擬研究高壓微射流和普魯蘭酶的聯(lián)合預改性對蓮子淀粉—單甘脂復合物性質的影響，測定復合物的復合率和直鏈淀粉含量；采用X-射線衍射和場發(fā)射掃描電鏡對蓮子淀粉—單甘脂復合物的晶體結構和表觀結構進行表征，揭示淀粉復合物結構特性的變化，并進一步探討其對復合物中淀粉組成的影響，以期為高壓微射流和普魯蘭酶的聯(lián)合預改性及V-型抗性淀粉的制備提供理論依據(jù)和技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮凍蓮：用于提取蓮子淀粉(參照Zhang等[7]的方法)，綠田(福建)食品有限公司；

單硬脂酸甘油脂：廣州市展帆化工有限公司；

普魯蘭酶：>1 000 U/mg，中國邯鄲河北吉杰生物科技有限公司；

α-淀粉酶：>50 U/mg，美國Sigma公司；

葡萄糖淀粉酶：>260 U/mg，美國Sigma公司；

直鏈淀粉/支鏈淀粉檢測試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 試驗儀器

微射流納米均質機：SPCH-EP-IC-16-30型，英國Stansted公司；

冷凍干燥機：VD-250R型，北京安捷來勒科技有限公司；

紫外—可見分光光度計：T6 新世紀型，北京普析儀器公司；

X-射線衍射儀：X-Pert Pro MPD X型，荷蘭Philips公司；

場發(fā)射掃描電鏡：JSM-6360LV型，日本電子株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 稱取15 g脫脂蓮子淀粉于250 mL燒杯中，配置成質量分數(shù)6%的蓮子淀粉懸浮液。將淀粉懸浮液放置于50 ℃水浴條件下攪拌加熱15 min，待懸浮液中顆粒溶解分散后，放入高壓微射流納米機中均質，均質條件參照Zheng等[8]的方法，分別在40，80，120 MPa下循環(huán)均質5次后取出，調節(jié)溶液pH(pH 5)和溫度(60 ℃)后，加入普魯蘭酶酶解1 h。酶解完成后，加等量體積分數(shù)95%的乙醇中停止酶反應后，加入單甘脂(基于蓮子淀粉干基的10%)，并參照常豐丹[9]關于水熱凝膠法制備淀粉—脂質復合物，75 ℃水浴條件下磁力攪拌30 min 后離心(4 500×g，10 min)，并用體積分數(shù)50%的乙醇水溶液清洗5次以去除未復合的單甘酯后，進行冷凍干燥。干燥后的復合物樣品粉碎過100目篩后，置于干燥皿中待用。作為對照，試驗分別制備了經普魯蘭酶預改性和75 ℃熱處理制備的蓮子淀粉—單甘脂復合物、只經75 ℃熱處理制備的蓮子淀粉—單甘脂復合物和只經75 ℃熱處理的天然脫脂蓮子淀粉，各對照樣品前處理均經50 ℃水浴條件下攪拌加熱15 min處理。

樣品編號：經75 ℃熱處理制備的天然脫脂蓮子淀粉標記為LS；經75 ℃熱處理制備的蓮子淀粉—單甘脂復合物標記為LSG；經普魯蘭酶預改性和75 ℃熱處理制備的蓮子淀粉—單甘脂復合物標記為LSG-P；在微射化壓力40，80，120 MPa下均質后經普魯蘭酶聯(lián)合預改性制備的蓮子淀粉—單甘脂復合物分別標記為LSG-P-M40，LSG-P-M80，LSG-P-M120。

1.3.2 直鏈淀粉測定 根據(jù)Zheng等[10]的方法，稱取20 mg 復合前淀粉樣品粉末與1 mL DMSO溶液混合置于燒杯, 用沸水浴加熱15 min后取出，加入體積分數(shù)95%的乙醇溶液混合離心(2 000×g，5 min)，用2 mL DMSO溶液繼續(xù)溶解沉積顆粒，并在沸水浴中加熱15 min。水浴加熱結束后，使用Concanavalin A solvent將淀粉樣品中的支鏈淀粉析出，再用D-葡萄糖(葡萄糖氧化酶/過氧化物酶)檢測試劑盒測定分析淀粉樣品中的直鏈淀粉含量。

1.3.3 復合率測定 根據(jù)Zheng等[8]的方法，稱取300 mg 樣品粉末均勻分散于5 mL 蒸餾水中，并經沸水浴加熱15 min后冷卻至室溫。冷卻的復合物溶液經離心(5 000×g，10 min)后，取50 μL的上清液與4 mL稀碘液(質量分數(shù)0.1%碘單質和質量分數(shù)2%碘化鉀)混合顯色，采用紫外分光光度計測定淀粉樣品610 nm處的吸光值，并按式(1)計算復合率。

(1)

式中：

CI——復合率，%；

ABScontrol——與測定樣品相同處理條件下脫脂蓮子淀粉的吸光值(不含單甘脂)；

ABSsample——蓮子淀粉—單甘脂復合物的吸光值。

1.3.4 X-射線衍射圖譜測定 采用D/MAX 2200PC X衍射儀，通過步進掃描法對淀粉樣品粉末的晶體結構進行測定。測定參數(shù)為：特征射線Cu Kα (λ=0.154 06 nm)，管壓40 kV，電流200 mA，測定的衍射角度2θ=0°～65°，掃描速率為5°/min。淀粉結晶區(qū)的區(qū)域劃分參照張本山等[11]的方法，分別為微晶區(qū)(MR)、亞結晶區(qū)(SR)和無定型區(qū)(AR)，淀粉樣品各晶區(qū)結晶度通過Jade 5.0軟件進行擬合峰面積計算，計算公式：

(2)

(3)

(4)

式中：

RMR——微晶區(qū)占總晶區(qū)的比例，%；

RSR——亞結晶區(qū)占總晶區(qū)的比例，%；

RAR——無定型區(qū)占總晶區(qū)的比例，%；

Ia——微晶區(qū)的區(qū)域面積；

Ib——亞結晶區(qū)的區(qū)域面積；

Ic——無定型區(qū)的區(qū)域面積。

1.3.5 場發(fā)射掃描電鏡測定 將樣品粉末均勻分散固定在導電膠金屬平臺上，并用洗耳球吹去浮粉，而后在低真空模式下噴涂薄金。涂金后的樣品將轉置于場發(fā)射掃描電子顯微鏡中以20 kV電子束進行掃描觀察，選取具有特征代表性的淀粉顆粒形貌照片并在5 000×的放大倍數(shù)下記錄拍攝。

1.3.6 淀粉組分含量測定 參照Zheng等[10]的方法，并稍作修改如下：稱取0.3 g樣品粉末均勻分散于5 mL蒸餾水中，而后調整淀粉懸浮液的pH至5.2，并轉承于50 mL 離心管中。向離心管中加入10 mL淀粉酶混合液(α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶)，并置于37 ℃恒溫水浴搖床中進行孵化(100 r/min)。在規(guī)定消化時間范圍(30，60，90，120，150，180 min)取出2 mL消化液，并加入體積分數(shù)95%乙醇溶液來終止酶反應，為防止消化液取出影響底物濃度，每根試管應獨立對應一個消化時間。孵化結束后，樣液經離心(6 570×g，10 min)后，采用DNS法對上清液中的葡萄糖含量進行測定，各樣品中的淀粉組分比例可根據(jù)以下方程式計算：

(5)

(6)

(7)

式中：

RRDS——淀粉組分中快消化淀粉比例，%；

RSDS——淀粉組分中慢消化淀粉比例，%；

RRS——淀粉組分中抗性淀粉比例，%；

G0 min——消化0 min時產生的葡萄糖含量；

G20 min——消化20 min時產生的葡萄糖含量；

G120 min——消化120 min時產生的葡萄糖含量；

WS——總淀粉質量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗數(shù)據(jù)均重復3次，P<0.05被認為數(shù)據(jù)之間具有顯著差異；另外，試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用DPS 9.50，試驗作圖采用Origin Pro 9.0。

2 結果與分析

2.1 高壓微射流對蓮子淀粉—單甘脂復合物直鏈淀粉含量的影響

不同微射化壓力與酶脫支的聯(lián)合預改性對蓮子淀粉—單甘脂復合物直鏈淀粉含量的影響如圖1所示。結果表明，相比未經預處理的蓮子淀粉樣品，單一的普魯蘭酶預改性對淀粉樣品中直鏈淀粉比率的增加具有一定的促進作用，但作用效果有限，可能是由于天然蓮子淀粉顆粒的包閉性，阻礙了酶的進一步滲透和脫支[4]。但隨著微射化預改性的介入，蓮子淀粉的直鏈淀粉比率隨微射化壓力的增加而升高，與Chen等[12]的研究一致，說明微射化效應有效地破壞了蓮子淀粉的顆粒結構，使脫支酶得以進入淀粉螺旋空腔內進行充分反應，并釋放纏結于支鏈淀粉簇狀結構中的直鏈淀粉。

小寫字母不同代表在不同預改性處理下樣品直鏈淀粉比率的顯著性差異(P<0.05)

2.2 高壓微射流對蓮子淀粉—單甘脂復合物復合率含量的影響

不同微射化壓力與酶脫支的聯(lián)合預改性對蓮子淀粉—單甘脂復合物復合率的影響如圖2所示。結果表明，未經預改性的蓮子淀粉—單甘脂復合物(LSG)，其復合水平較低，僅為(27.26±2.44)%。相較下，LSG-P的復合率比其高出12.33%，這一結果證實了Liu等[13]的研究，即脫支處理產生的更多的直鏈淀粉，會更有利于淀粉復合物的生成。同樣，當蓮子淀粉經高壓微射流與酶脫支的聯(lián)合改性后，復合率出現(xiàn)了進一步的升高，特別是當微射化壓力達到80 MPa時，復合率高達(59.61±5.16)%，說明高壓微射流效應對普魯蘭酶脫支效果的提升是可行有效的。但隨著均質壓力進一步升高至120 MPa，LSG-P-M120的復合率相比LSG-P-M80下降了27.03%，這一現(xiàn)象可能歸咎于高強度的微射流效應在破壞支鏈淀粉簇狀結構的同時，還會進一步剪切體系中的游離直鏈淀粉[8]。有研究[14]表明，過短的直鏈淀粉會影響淀粉與脂質間的復合，因為脂質分子無法進入過小的淀粉螺旋空腔內與之發(fā)生螺旋組裝。由此可見，微射化壓力的選擇對淀粉復合物的形成起著關鍵的調控作用。

2.3 高壓微射流對蓮子淀粉—單甘脂復合物晶體結構的影響

由圖3觀察發(fā)現(xiàn)，蓮子淀粉在衍射角(2θ)15.02°，17.15°，17.96°，20.03°，22.76°，23.98°處出現(xiàn)強烈的衍射峰型，是蓮子淀粉的C-型特征晶體衍射圖[2]。隨著單甘脂加入淀粉體系內，LSG在衍射角7.1°，12.5°，20.3°處出現(xiàn)了信號較弱的V-型特征衍射峰型，表明此時有少部分的淀粉—脂質復合物生成[12]。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，LSG衍射圖譜中的A-型晶體衍射強度相比LS要有一定程度的增強，相反B-型晶體的特征衍射消失。He等[15]的研究報道解釋了這一現(xiàn)象，其認為C型淀粉結構中B-型晶核位于淀粉粒的外周區(qū)或周圍帶，容易受到外界因素的干擾和破壞。并且，相比“穩(wěn)固態(tài)六角形”的A型單斜晶格，B-型“空心六邊形”的晶格穩(wěn)定性較差，致使脂質分子進入螺旋空腔后會首先利用較不穩(wěn)定的B-型晶核區(qū)域而形成新的單螺旋結構。然而，隨著普魯蘭酶的介入，脫支效應促進了蓮子淀粉與脂質間的復合，并刺激淀粉內部的A-型晶格區(qū)域發(fā)生轉化，形成較為穩(wěn)定的V6II-型晶體結構[8]，這可從LSG-P的衍射圖譜中觀察發(fā)現(xiàn)，即較強的V-型晶態(tài)衍射以及微弱的A型晶態(tài)衍射。相較下，高壓微射流和酶的聯(lián)合處理對蓮子淀粉—單甘脂復合物的形成要更具優(yōu)勢。從LSG-P-M40的圖譜中發(fā)現(xiàn)，衍射角僅在7.1°，12.5°，20.3°處出現(xiàn)強烈的峰型衍射，表明淀粉復合物形成了V6I-型的完全結晶態(tài)[16]。另一方面，隨著均質壓力升高至80，120 MPa，衍射圖譜中又再次出現(xiàn)B-型的晶體衍射形態(tài)，可能是由于直鏈淀粉重結晶所致[17]，因為在高壓微射流壓力下的酶脫支所產生的直鏈淀粉數(shù)量多于單甘脂的復合需求，而其余的直鏈淀粉單螺旋會在回生過程中再次締合，形成B-型晶態(tài)的直鏈淀粉雙螺旋。

小寫字母不同代表在不同預改性處理下樣品復合率的顯著性差異(P<0.05)

圖3 蓮子淀粉—單甘脂復合物的晶區(qū)衍射

此外，相比其他樣品，LSG-P-M80的微晶區(qū)比例達到較高水平，為(20.37±0.68)%[圖4(a)]，結合上述表明淀粉微晶區(qū)的形成可能與V-型復合物間存在重要關聯(lián)。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，LSG-P-M120的微晶區(qū)比例大幅下降，而亞晶區(qū)比例卻顯著上升[圖4(b)]，與Zheng等[14]的研究結果相似，其指出過度的脫支可能會導致淀粉的結晶方向更傾向于不完全態(tài)的B-型晶核，引起淀粉亞結晶區(qū)的比例升高。

2.4 高壓微射流對蓮子淀粉—單甘脂復合物顆粒微觀形態(tài)的影響

由圖5(a)觀察發(fā)現(xiàn)，在75 ℃的單一熱處理條件下天然脫脂蓮子淀粉的顆粒表面變得光滑且疏松，顯示出較大面積的團狀聚集形態(tài)，這是蓮子淀粉初步凝膠化的特征表現(xiàn)[18]。當單甘脂加入淀粉體系后，淀粉圖譜中開始出現(xiàn)少許完整的凹陷顆粒且凝膠化現(xiàn)象減弱[圖5(b)]，特別當酶脫支[圖5(c)]或與低壓微射化的聯(lián)合預改性[圖5(d)]后，蓮子淀粉顆粒的微觀輪廓開始逐漸清晰且凝膠化現(xiàn)象消失，表明V-型復合物的形成對淀粉的凝膠回生具有抑制作用。相比LSG-P-M40，LSG-P-M80的微觀形貌圖中再次出現(xiàn)了凝膠化現(xiàn)象[圖5(e)]，并且隨著微射化壓力升高至120 MPa，這一現(xiàn)象變得更為顯著，即大面積凝膠包裹著輪廓清晰的淀粉顆粒[圖5(f)]。Zheng等[14]在普魯蘭酶與超聲波聯(lián)合預改性的試驗中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，其認為是由于過度脫支所導致許多未復合的游離直鏈淀粉發(fā)生重締合排列，形成的復凝膠化現(xiàn)象。

小寫字母不同代表在不同預改性處理下樣品同晶區(qū)比例的顯著性差異(P<0.05)

A. LS B. LSG C. LSG-P D. LSG-P-M40 E. LSG-P-M80 F. LSG-P-M120

2.5 高壓微射流對蓮子淀粉—單甘脂復合物淀粉組分含量的影響

由圖6可知，相比LS和LSG，經普魯蘭酶預改性的LSG-P的抗性淀粉比例顯著提升，尤其當高壓微射流介入(80 MPa)后，淀粉復合物組分中的抗性淀粉比例高達(49.61±2.76)%，說明V-型復合物可作為抗性淀粉的新型制備來源。Chen等[19]在對蓮子淀粉—單甘酯復合物片層結晶的研究結果指出，復合物的形成會使淀粉顆粒的層相呈更有序化的晶體形態(tài)，并依靠這些片層微晶的生長提升淀粉的抗酶解能力。另有研究[20]表明，V6I-型復合物的形成會導致淀粉顆粒表面形成一層不溶性的薄膜屏障，這不僅會阻礙水分子進入淀粉顆粒，也會抑制酶對淀粉的水解作用。

此外，當微射流壓力達到120 MPa時，蓮子淀粉—單甘脂復合物的抗性淀粉比例卻出現(xiàn)大幅下降，而慢消化淀粉比例上升。Wei等[21]通過對普魯蘭酶降解玉米蠟質淀粉的結構和體外消化率的研究中也發(fā)現(xiàn)了這個現(xiàn)象，其認為直鏈淀粉的過度枝化可能更有利于淀粉無定型區(qū)和不完全晶體的形成，即具有不完美雙螺旋結構的III-型抗性晶體，因而增加了慢消化淀粉的比例，也對應了X-射線衍射測定結果中亞結晶區(qū)比例的升高。

3 結論

研究高壓微射流和普魯蘭酶的聯(lián)合預改性對蓮子淀粉—單甘脂復合物結構和淀粉組成的影響。結果表明，適宜的微射流壓力(80 MPa)有利于普魯蘭酶脫支并釋放更多的游離直鏈淀粉于淀粉體系內，這對促進蓮子淀粉和單甘脂復合有著良好的推動作用。并且通過進一步結構研究發(fā)現(xiàn)，80 MPa的微射流預改性可促進高微晶態(tài)V6I-型復合物的形成，并抑制蓮子淀粉的凝膠化現(xiàn)象，維持淀粉顆粒結構的穩(wěn)定性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，80 MPa的微射流條件下形成的V6I-型復合物，其淀粉組分中具有較高的抗性淀粉比例，而隨著壓力進一步上升，淀粉組分中的抗性淀粉比例會下降而慢消化淀粉比例升高。這些結果表明高微晶含量及顆粒結構穩(wěn)定性對提高淀粉抗消化性具有良好的促進作用，但關于微晶片層及分子雙螺旋結構對淀粉消化特性的調控機制，有待進一步通過宏觀、微觀和介觀等多尺度角度進行深入研究。

小寫字母不同代表在不同預改性處理下樣品同組分含量的顯著性差異(P<0.05)