許彩麗， 周易秈森， 謝喬穎， 徐慶國， 王旭軍

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 湖南 長沙 410128； 2.中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院， 湖南 長沙 410004； 3.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004)

箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.) Maxim.為小檗科Berberidaceae淫羊藿屬EpimediumL.多年生草本植物，俗名三枝九葉草、仙靈脾等，廣泛分布于湖南、湖北、江西等地，生長在海拔200～1 750 m的山坡草叢、林下、灌叢、水溝邊或巖邊石縫中，與淫羊藿、朝鮮淫羊藿和柔毛淫羊藿等的干燥葉均為《中國藥典》中藥材淫羊藿的基源植物，具補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效，臨床上主要用于治療骨質(zhì)疏松、更年期綜合征、高血壓、冠心病等[1-4]?，F(xiàn)代藥理研究還表明，箭葉淫羊藿中的黃酮類化合物對(duì)肺癌、肝癌和白血病等病癥具有積極療效，從而進(jìn)一步增加了淫羊藿藥材的社會(huì)需求量，由于其種植技術(shù)尚未發(fā)展成熟，導(dǎo)致箭葉淫羊藿的野生資源不斷減少[5-7]。目前關(guān)于箭葉淫羊藿的研究主要集中于化學(xué)成分、藥理作用和新藥開發(fā)等方面[8]，而關(guān)于其規(guī)范化的栽培技術(shù)研究和生理生態(tài)方面的研究報(bào)道少見。作者前期研究結(jié)果表明，中度干旱脅迫處理( 60%～65% )下的箭葉淫羊藿生長較好[9]。本文進(jìn)一步測定了不同干旱脅迫處理下箭葉淫羊藿葉片葉綠素、抗逆性酶和丙二醛等生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律，以期為箭葉淫羊藿規(guī)范化栽培提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在湖南省長沙市雨花區(qū)國家林下經(jīng)濟(jì)示范基地(113°01′30″E， 28°06′40″N)，海拔60～80 m。該地區(qū)屬于中亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，四季分明，年平均氣溫17.2 ℃，年均日照1 496～1 550 h、無霜期264 d，年降水量1 400～1 900 mm。土壤為地帶性第四紀(jì)紅壤，土壤的成土母巖為第四紀(jì)網(wǎng)紋層母質(zhì)， pH值為4.5～5.5。

1.2 試驗(yàn)材料

2019年1月，在下口直徑為10 cm、上口直徑為15 cm、高度為14 cm的塑料盆中種植生長良好且生長趨勢基本相同的箭葉淫羊藿植株，并將其置于避雨棚。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2019年8月，盆栽中的箭葉淫羊藿植株恢復(fù)生長后進(jìn)行干旱脅迫試驗(yàn)。干旱脅迫試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，參照趙麗萍等[10]研究設(shè)置3個(gè)不同處理：對(duì)照組CK、輕度干旱脅迫T1和重度干脅迫T2，其土壤含水量分別為田間最大持水量的70%～75%、60%～65%和50%～55%。

根據(jù)箭葉淫羊藿一年三出復(fù)葉的特點(diǎn)，以當(dāng)年成熟復(fù)葉的中間葉為試驗(yàn)葉進(jìn)行測定。2019年8月1日至9月4日，每7天取樣1次。共取樣5次。

1.4 測定指標(biāo)與方法

葉綠素含量和丙二醛(malondialdehyde， MDA)含量測定參照李合生[11]的方法，采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的過氧化物酶(peroxidase， POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)試劑盒分別測定POD和SOD活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析方法

采用Microsoft Excel 2016、SPSS 19.0和Prism 6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)箭葉淫羊藿葉綠素含量的影響

葉綠素含量的高低直接影響到植物的光合能力，是反映植物葉片生理活性變化的主要指標(biāo)之一，干旱脅迫則會(huì)影響植物葉綠素含量的變化，進(jìn)而影響植物的光合作用[12-13]。

由圖1可知，處理前期，箭葉淫羊藿干旱脅迫T1和T2處理的葉綠素含量低于CK處理，但并無顯著差異；隨著處理時(shí)間的增加，處理中期T1和T2處理的葉綠素整體顯著高于CK處理(P<0.05)；在處理后期，處理T1顯著低于CK處理且顯著高于T2處理，處理T2顯著低于CK和T1(P<0.05)。在干旱脅迫處理過程中，箭葉淫羊藿葉片中的葉綠素含量變化從整體上看，走勢為先升后降，說明干旱脅迫會(huì)使箭葉淫羊藿葉綠素含量發(fā)生變化，影響其生成。

2.2 干旱脅迫對(duì)箭葉淫羊藿過氧化物酶(POD)活性的影響

POD是細(xì)胞活性氧保護(hù)酶系統(tǒng)的成員之一，其作用是清除H2O2，保護(hù)植物體免受傷害[14]。從圖2可以看出，在8月21日之前，各處理的POD活性無顯著差異；隨著處理時(shí)間的延長，在處理中期，處理T1的POD活性與處理CK無顯著差異，但高于處理CK，而處理T2的POD活性顯著高于處理CK和T1，說明隨著干旱脅迫時(shí)間的延長和程度的增加，箭葉淫羊藿細(xì)胞膜系統(tǒng)遭受到的傷害程度也逐漸加大，植物通過增加POD 活性來降低自由基大量產(chǎn)生造成的過氧化傷害；在8月21日之后，處理T1和T2的POD活性迅速下降，8月28日與8月21日相比POD活性分別下降86.38%和93.48%，9月4日與8月21日相比POD活性分別下降96.05%和99.41%，8月21日之后的POD基本無活性，且均顯著低于處理CK，處理T2與T1無顯著差異，但T1的POD活性較高于T2，脅迫處理的POD變化趨勢與夏鵬云等[15]在大葉冬青葉片的研究中S3處理相似，但箭葉淫羊藿的下降要更加劇烈。表明在長時(shí)間的干旱脅迫條件下，植物細(xì)胞忍受活性氧的程度很有可能存在閾值，一旦超過了這個(gè)閾值，將會(huì)使植物遭受到極大的傷害[15]。

2.3 干旱脅迫對(duì)箭葉淫羊藿超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

細(xì)胞在維持正常生長和發(fā)育的過程中，離不開起著著非常重要作用的自由基清除劑SOD[16]。從圖3可以看出，隨著處理時(shí)間的延長，3個(gè)處理水平 SOD 活性表現(xiàn)趨勢不同。CK處理與T2處理SOD 活性走勢一致，均為先迅速上升后急劇下降，8月21日達(dá)到峰值，處理CK與T2在各個(gè)處理時(shí)期均無顯著差異；T1處理中的SOD 酶活性不斷增強(qiáng)，在處理前期和CK處理無顯著差異，在處理后期卻顯著高于處理CK和T2。說明，在8月21日之前，植物激活并不斷產(chǎn)生SOD清除大量的自由基；在8月21日之后，隨著脅迫時(shí)間的增加，T2處理的箭葉淫羊藿植株受到傷害，SOD的產(chǎn)生受到抑制，T2處理SOD 活性開始并持續(xù)降低；T1處理的箭葉淫羊藿能夠繼續(xù)產(chǎn)生SOD來清除干旱脅迫產(chǎn)生的自由基，降低傷害。

2.4 干旱脅迫對(duì)箭葉淫羊藿丙二醛(MDA)含量的影響

MDA作為膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，可以和酶結(jié)合、交聯(lián)使酶失活，從而破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，膜脂過氧化強(qiáng)弱一般用于表示評(píng)價(jià)逆境下自由基對(duì)細(xì)胞膜的傷害度，細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的高低，也是膜系統(tǒng)受傷害的重要標(biāo)志之一[17-18]，MDA含量越高，膜被傷害程度越重。

由圖4可知，3個(gè)處理水平丙二醛含量的變化趨勢整體上是一致的，呈雙峰型，均為有規(guī)律地上下波動(dòng)。隨著處理時(shí)間的增加，MDA含量開始不斷增加，8月21日MDA含量下降，此時(shí)保護(hù)酶POD和SOD活性增加，說明POD和SOD同時(shí)作用，在受到干旱脅迫后箭葉淫羊藿植株進(jìn)行自我調(diào)整；隨脅迫時(shí)間的增加，各脅迫處理的MDA含量繼續(xù)增多，說明干旱脅迫對(duì)箭葉淫羊藿植株的影響增大，使得箭葉淫羊藿葉片中的保護(hù)酶活性降低，進(jìn)而活性氧大量積累，膜脂過氧化嚴(yán)重，MDA含量增多；最后通過再次調(diào)節(jié)使得MDA含量在9月4日下降，處理T1的MDA含量顯著低于處理CK、T2，說明干旱脅迫對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生了一定的傷害，但箭葉淫羊藿植株仍能通過自我調(diào)整降低傷害，且處理T1的受傷害程度低于對(duì)照處理CK和處理T2。

3 討論

3.1 干旱脅迫對(duì)箭葉淫羊藿葉綠素含量的影響

光合色素不僅作為植物將無機(jī)物變成有機(jī)物的關(guān)鍵介質(zhì)，而且也是反映植物光合能力和營養(yǎng)作用的重要指標(biāo)之一，光合色素含量與各組分之間的比例對(duì)植物光合作用影響很大，并在一定程度上影響植株的正常生長及抗逆性[19]。

有研究表明，干旱脅迫導(dǎo)致植物葉片上的氣孔關(guān)閉或植物葉肉細(xì)胞損傷、光合酶的活性降低，活性氧大量積累，抑制葉綠素的合成，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，加速其分解，引起葉綠素含量降低，光合速率降低，影響對(duì)光能的吸收和利用[20-22]。

王銘涵等[23]和沈思言等[24]對(duì)茶樹研究結(jié)果表明干旱脅迫下葉綠素含量增高，而郭春芳[25]和劉玉英等[13]對(duì)茶樹的研究結(jié)果表明干旱脅迫下葉綠素含量減少。本研究中，干旱脅迫處理下的箭葉淫羊藿葉綠素整體呈先升高后降低的趨勢，分析可能是土壤體積含水量和箭葉淫羊藿葉片的相對(duì)含水量在干旱脅迫處理前期時(shí)均下降到較低水平，葉片中的葉綠素表現(xiàn)為濃縮狀態(tài)，使得單位葉鮮重中葉綠素含量增加，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長和程度的增加，箭葉淫羊藿細(xì)胞內(nèi)生理生化發(fā)生改變，葉綠體小部分降解，并且進(jìn)一步抑制了部分葉綠素合成酶的活性，使葉綠素合成受阻，導(dǎo)致葉綠素合成量明顯降低。這與曲東等[26]人進(jìn)行的干旱脅迫下硫?qū)τ衩兹~綠素含量的影響研究結(jié)果一致。在處理后期重度干旱脅迫下葉綠素合成量顯著低于中度和對(duì)照組，重度干旱脅迫下箭葉淫羊藿植株葉綠素合成受脅迫影響最大，中度干旱脅迫影響較小。

3.2 干旱脅迫對(duì)箭葉淫羊藿SOD、POD 活性和MDA 含量的影響

當(dāng)植物在無脅迫環(huán)境中生長，細(xì)胞中自由基的產(chǎn)生和清除表現(xiàn)為動(dòng)態(tài)平衡；在干旱脅迫下，植物體內(nèi)積累過量的活性氧自由基，引發(fā)細(xì)胞膜脂過氧化，終產(chǎn)物 MDA 含量增加，細(xì)胞膜的完整性被破壞，細(xì)胞代謝紊亂，植物組織造成損傷，為了緩解干旱脅迫下引起的傷害，體內(nèi)會(huì)迅速啟動(dòng)抗氧化的消除系統(tǒng)，激發(fā)SOD、POD等保護(hù)酶[17，27]。本研究中，箭葉淫羊藿POD、SOD保護(hù)酶活性和MDA含量在干旱脅迫處理期間均有變化，POD活性總體趨勢為先升高后下降，這與賈鑫等[27]人對(duì)蒙古黃芪的研究結(jié)果與張翠梅等[28]人對(duì)苜蓿的研究結(jié)果基本一致；SOD活性除處理T1為持續(xù)上升外，處理CK與處理T2均先增加后降低，MDA含量的三個(gè)處理均呈雙峰曲線。

當(dāng)干旱脅迫發(fā)生時(shí)，箭葉淫羊藿為了避免細(xì)胞膜遭受氧化傷害，激發(fā)保護(hù)酶，在一定程度上能提高保護(hù)酶 SOD和POD的活性，積極應(yīng)對(duì)干旱脅迫形成的威脅，緩解自由基大量產(chǎn)生而造成植物細(xì)胞過氧化損傷，但是箭葉淫羊藿植株的POD、SOD僅在一定范圍上保持有清除自由基的能力，在長時(shí)間和重度干旱脅迫下，箭葉淫羊藿植株的保護(hù)酶 SOD和POD活性最后均逐漸降低，其抗氧化能力將逐漸衰退；而中度干旱脅迫下的箭葉淫羊藿植株仍然能夠激發(fā)保護(hù)酶，繼續(xù)積極應(yīng)對(duì)干旱脅迫。

MDA含量對(duì)SOD活性有抑制作用，抑制效應(yīng)與MDA含量成正比，隨著MDA含量的增大抑制效應(yīng)而增強(qiáng)[29]。在干旱脅迫處理時(shí)，MDA整體上不斷積累且不可逆地抑制 SOD活性，中度干旱脅迫處理T1在處理中后期MDA含量較重度干旱脅迫處理T2小，對(duì)處理T1的SOD活性抑制度不夠強(qiáng)，處理T1的SOD曲線持續(xù)增加；重度干旱脅迫處理T2中高濃度MDA抑制SOD活性，SOD曲線降低，這可能是SOD活性與POD活性變化趨勢在干旱脅迫處理過程中不一致的原因。而對(duì)照組CK的MDA含量始終高于干旱脅迫處理，暗示了除了膜脂過氧化作用以外，在植物生長過程中還有別的生理過程參與質(zhì)膜透性的改變。

4 結(jié)論

箭葉淫羊藿干旱脅迫處理下葉綠素含量均受到影響，且重度干旱脅迫處理的箭葉淫羊藿植株葉綠體降解較為嚴(yán)重，抑制了部分葉綠素合成酶的活性，葉綠素明顯降低。POD、SOD保護(hù)酶和MDA有協(xié)同作用，能夠通過自我調(diào)節(jié)來應(yīng)對(duì)不利環(huán)境，減少損傷，中度干旱脅迫下的箭葉淫羊藿植株仍然能夠激發(fā)保護(hù)酶、繼續(xù)積極應(yīng)對(duì)干旱脅迫，而重度干旱脅迫處理較中度干旱脅迫處理膜脂過氧化作用強(qiáng)，重度干旱脅迫處理受到的傷害最大。