蔣鵬娜 王麗潔 李 星 李竹英

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

支氣管哮喘是由包括氣道炎性細胞和結(jié)構(gòu)細胞（如嗜酸粒細胞、T淋巴細胞、氣道上皮細胞等）在內(nèi)的多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點[1]。哮喘的病理生理狀態(tài)研究較多的主要有：氣道重塑、氣道炎癥、黏液蛋白過度分泌和氧化應(yīng)激過度[2]。近些年來自噬在呼吸系統(tǒng)疾病中作用機制的不斷被挖掘，許多學(xué)者證實了自噬主要通過調(diào)節(jié)基因[3]、氧化應(yīng)激、T細胞免疫調(diào)節(jié)[4]、病毒侵襲[5]等多方面影響哮喘的發(fā)生、發(fā)展。筆者通過觀察平喘顆粒含藥血清對氣道上皮細胞自噬及凋亡的影響，以探討該藥的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級Wistar大鼠，48只雌雄各半，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，許可證號：SYXK（黑）2015-003，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄分籠飼養(yǎng)，自由飲食，在室溫（22±2）℃、濕度（50±10）%條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)，觀察大鼠在進食、飲水、二便、活動方面均無異常，1周后正式進行動物實驗。

1.2 藥物與試劑

平喘顆粒由淫羊藿、炙麻黃、黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍、罌粟殼、知母共9味藥物組成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制備，規(guī)格10 g/袋，批號20150102；人支氣管上皮細胞（16HBE），購自上海中國科學(xué)院細胞庫（CBP60550）；胎牛血清（FBS）來自Sigma公司，雷帕霉素來自上海源葉生物公司，氯喹來自Sigma公司。

1.3 含藥血清的制備

取健康清潔級Wistar大鼠，平喘顆粒連續(xù)給藥3 d（將平喘顆粒稀釋至0.54 g/mL，每次按1 mL/100 g灌胃），末次給藥前禁食12 h，給藥2 h后麻醉，腹主動脈取血，采血后靜置30 min，常規(guī)分離血清，56℃水浴滅活補體30 min，過濾器過濾，密封，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。通過實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)含藥（平喘顆粒）血清濃度為20%時[9]，對雷帕霉素誘導(dǎo)的16HBE細胞有較明顯的抑制作用，故實驗中選用該濃度。

1.4 細胞分組、加藥及收集

取對數(shù)生長期的16HBE貼壁細胞，調(diào)整細胞濃度為2×105個/mL，將細胞按照常規(guī)方法接種于細胞培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下細胞密集度達到70%時，將細胞分為正常培養(yǎng)基細胞組（正常對照組）、雷帕霉素組、雷帕霉素加氯喹組、雷帕霉素加中藥組。將雷帕霉素組、雷帕霉素加氯喹組、雷帕霉素加中藥組分別加入雷帕霉素800 μL，對照組加入等量的DMEM不完全培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)12 h后棄去各組培養(yǎng)基，重新將正常對照組、雷帕霉素組分別加入800 μL DMEM不完全培養(yǎng)液，雷帕霉素加氯喹組加入800 μL氯喹溶液，雷帕霉素加中藥組加入800 μL含中藥血清，再次放置細胞培養(yǎng)箱中24 h。棄去各組培養(yǎng)液，常規(guī)消化細胞，分別刮取收集各組細胞，保存至1.5 mL離心管內(nèi)。

1.5 電鏡下觀察細胞自噬

棄去培養(yǎng)液，常規(guī)消化細胞，刮取細胞，分別收集各組細胞，用戊二醛固定后，按照電鏡操作流程處理細胞后觀察各組細胞自噬情況。

1.6 流式細胞儀測定細胞凋亡情況

收集培養(yǎng)的細胞，調(diào)成密度為5×105個/mL，按照操作流程進行流式細胞檢測，Anneexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶（PI）為紅色熒光，在流式細胞儀的散點圖上，正常的活細胞不被Anneexin V-FITC和PI染色；凋亡早期的細胞僅被Anneexin V-FITC染色，PI染色呈陰性；壞死細胞和凋亡晚期細胞可以同時被Anneexin V-FITC和PI染色。散點圖的左上象限是可允許范圍內(nèi)的檢測誤差。

1.7 Westen blotting方法檢測細胞中自噬效應(yīng)蛋白-1（Beclin-1）、Caspase-3蛋白表達

將準備就緒的各組細胞按照BCA蛋白濃度檢測說明書進行測定，利用酶標儀讀取OD值，在蛋白定量后用還原樣品加熱，使蛋白變性，電泳、濕轉(zhuǎn)、封閉、一抗孵育、二抗孵育及膠片曝光、定影等過程同膠片掃描后分析結(jié)果。檢測各組細胞中自噬相關(guān)基因蛋白Beclin-1、Caspase-3的表達水平，并對其條帶灰度值進行定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 電鏡檢測結(jié)果

2.1.1 雷帕霉素誘導(dǎo)12 h 16HBE觀察 見圖1。正常對照組中細胞核染色質(zhì)豐富且均勻，可清晰見到線粒體及完整峭結(jié)構(gòu)，細胞整體形態(tài)良好；經(jīng)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素作用后，其余3組中部分細胞內(nèi)可見單層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡，內(nèi)含細胞器腫脹變形，部分線粒體空泡化，峭開始溶解。

圖1 各組12 h 16HBE電鏡結(jié)構(gòu)圖（25 000倍）

2.1.2 雷帕霉素誘導(dǎo)后加藥物干預(yù)電鏡觀察 見圖2。正常對照組中細胞基本結(jié)構(gòu)及形態(tài)完好，細胞核染色質(zhì)豐富、分布均勻，胞內(nèi)可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體，峭較完整；加氯喹干預(yù)后24 h，細胞結(jié)構(gòu)基本正常，可見自噬泡，少量線粒體出現(xiàn)峭溶解斷裂；加中藥血清干預(yù)后24 h，細胞基本形態(tài)較好，可見到自噬泡和線粒體，其中線粒體峭較完整。由圖可見，經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)的細胞內(nèi)改變了正?；窘Y(jié)構(gòu)，出現(xiàn)了線粒體腫脹，甚至溶解、空泡化。而分別在氯喹和含藥血清干預(yù)已自噬的細胞后，其內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)均明顯改善，細胞活力增加，說明由雷帕霉素引起的自噬在氯喹或者中藥平喘顆粒的干預(yù)下可以得到抑制或者改善，從而對細胞起到保護作用。

圖2 各組細胞電鏡結(jié)構(gòu)圖（25 000倍）

2.2 各組細胞凋亡情況比較

見表1，圖3。經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)后，16HBE細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均增加（P＜0.05）。而經(jīng)氯喹阻斷后，細胞晚期凋亡率明顯下降（P＜0.05），而早期凋亡率下降不明顯（P＞0.05），總凋亡率也呈下降趨勢（P＜0.05）。經(jīng)平喘顆粒干預(yù)后，細胞早期凋亡率變化也不明顯（P＞0.05），晚期凋亡率明顯下降（P＜0.05），總凋亡率也呈下降趨勢（P＜0.05）。

表1 各組細胞凋亡率比較（%，±s）

表1 各組細胞凋亡率比較（%，±s）

與正常對照組比較，?P＜ 0.05，??P＜ 0.01；與雷帕霉素組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組別正常對照組雷帕霉素組雷帕加氯喹組雷帕加中藥組n 6 6 6 6早期凋亡率6.135±0.422 10.125±0.635**14.581±1.232**10.056±1.114**晚期凋亡率9.123±0.307 26.843±2.136**12.426±1.667**△△17.011±1.606**△△總凋亡率16.012±0.823 35.266±2.736**26.758±2.697**△△26.903±2.792**△△

圖3 各組細胞凋亡流式檢測結(jié)果

2.3 各組Beclin-1、Caspase-3蛋白表達的比較

見表2，圖4。結(jié)果顯示，雷帕霉素組和雷帕加氯喹組Beclin-1、Caspase-3的表達較正常對照組顯著增高（P＜0.05或P＜0.01），其中雷帕霉素組上述指標的表達較雷帕加中藥組增高（P＜0.05）。在雷帕霉素誘導(dǎo)的細胞自噬和凋亡中，自噬和凋亡二者相互促進，Caspase-3蛋白表達增加，而氯喹和中藥平喘顆粒組Caspase-3蛋白表達受抑制。

表2 各組Beclin-1、Caspase-3蛋白表達的比較（±s）

表2 各組Beclin-1、Caspase-3蛋白表達的比較（±s）

組別正常對照組雷帕霉素組雷帕加氯喹組雷帕加中藥組n 6 6 6 6 Beclin-1 GAPDH 0.61±0.33 0.82±0.37**0.71±0.29*△△0.43±0.30**△△Caspase-3 GAPDH 0.46±0.27 0.97±0.30**0.55±0.22*△△0.54±0.25*△△

圖4 各組細胞自噬相關(guān)基因蛋白的表達

3 討論

劉建秋教授根據(jù)多年治療哮喘慢性持續(xù)期或者緩解期的經(jīng)驗，總結(jié)出了“見痰不治痰，重用溫藥，既化飲又給邪以出路，補中有消，溫中有行，開中有闔”的學(xué)術(shù)觀點。平喘顆粒為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)院內(nèi)制劑，由淫羊藿、炙麻黃、黃芪、太子參、五味子等9味藥物組成。前期臨床研究表明平喘顆粒用于慢性持續(xù)期的陽虛痰盛證哮喘患者治療效果尤佳，亦可用于具有相同癥狀的其他咳喘病[6-7]。在前期平喘顆粒藥效學(xué)研究中該藥物可促進小鼠氣管酚紅的排泄量和促進呼吸道上皮纖毛運動，促使痰液稀釋并發(fā)揮排痰的作用[8]。也有研究表明哮喘發(fā)病時引起氣道上皮細胞和平滑肌細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，而結(jié)局則是以細胞重回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)、細胞自噬或細胞凋亡等形式結(jié)束[9]。氣管上皮細胞的新陳代謝中自噬與凋亡是細胞死亡的一種方式，自噬可以促進凋亡發(fā)生，又可以通過提供營養(yǎng)和能力發(fā)揮防御作用，抑制凋亡或者延遲凋亡，而在調(diào)控方面，二者又可獨立發(fā)揮作用，導(dǎo)致細胞死亡[10]。Beclin-1作為自噬的直接執(zhí)行者，不僅可促進自噬吞噬體形成[11]，增加自噬發(fā)生[12]，同時參與上皮細胞凋亡[13]。劉娟等提出在哮喘患者中Beclin-1可能同時參與上皮細胞凋亡和自噬的過程，調(diào)控炎癥細胞因子的表達，緩解哮喘的急性發(fā)作與慢性病程[14]。Caspases又稱凋亡蛋白酶，Caspase-3處于兩條凋亡信號通路的中心位置，通過介導(dǎo)特異性肽鍵，引起凋亡級聯(lián)反應(yīng)[15-16]，執(zhí)行細胞最終凋亡過程[17]。國內(nèi)研究表明在嬰幼兒喘息性疾病的研究中[18]，嗜酸性粒細胞中的凋亡因子Caspase-3活性降低，抗凋亡Bcl-2基因表達增多，在兩者共同作用下導(dǎo)致嗜酸性粒細胞凋亡減緩，使得患兒外周血中嗜酸性粒細胞相對增多。

本實驗用雷帕霉素[19]誘導(dǎo)16HBE細胞自噬，通過電鏡發(fā)現(xiàn)自噬的標志性結(jié)構(gòu)-自噬泡的存在，還觀察到凋亡細胞，并用流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況，其結(jié)果均明顯出現(xiàn)自噬和凋亡指征，凋亡率明顯增加，自噬泡及溶酶體增多，凋亡標志蛋白酶Caspase-3/Beclin-1表達均顯著增加，而應(yīng)用自噬抑制劑氯喹和中藥平喘顆粒后，凋亡率、自噬數(shù)量、Caspase-3、抑凋亡蛋白Beclin-1表達均明顯下降。實驗證實雷帕霉素激活氣道上皮細胞自噬途徑后，平喘顆粒有類氯喹作用，在哮喘發(fā)病的自噬過程中對病變細胞的凋亡與自噬起抑制作用，且此過程中凋亡與自噬二者呈正相關(guān)。