譚 娟 ， 向德標(biāo) ， 袁袆玲 ， 徐夢(mèng)婷

（1.懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化 418008）

葛花又名葛條花，為豆科植物野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）或甘葛藤（P.thomsonii Benth）的干燥未開放花蕾[1].據(jù)《中國(guó)藥典》記載，葛花為藥食同源植物，是一種純天然的野生植物，性涼，味甘，入陽明經(jīng)，如脾胃等，也是我國(guó)傳統(tǒng)民間草藥和保健飲料植物[2].現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，葛花的主要活性成分為總黃酮和皂苷類，而黃酮類成分含量最高，黃酮里葛根素亦是主要成分[3].已有報(bào)道表明，葛花總黃酮對(duì)體內(nèi)活性氧自由基（ROS）的產(chǎn)生有抑制作用，可提高組織抗氧化能力，不僅可預(yù)防和治療衰老性疾病[4]，同時(shí)具有明顯預(yù)防酒精性肝損傷、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦血管、降低心肌耗氧量、改善心肌功能的作用，對(duì)心血管具有保護(hù)作用等[5，6].

葛花藥用療效較為廣泛，有較高的科研價(jià)值，但在現(xiàn)代中醫(yī)藥研究中對(duì)于葛花的研究仍然不夠深入，在其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、作用機(jī)理等方面有必要展開進(jìn)一步研究.本實(shí)驗(yàn)采用離體蛙心灌流經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，借助BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，通過對(duì)比觀察不同濃度葛花醇提液對(duì)離體蛙心收縮功能的影響，以及葛花醇提液與心肌膜上受體的關(guān)系，對(duì)心臟收縮的機(jī)制進(jìn)行探討，以期為葛花的深入開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

葛花為江西省上饒市售野生干葛花.由懷化學(xué)院劉良科教授鑒定為野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為美國(guó)青蛙（Rana grylio），雌雄不限，體重（350±50 g），購(gòu)于懷化本地.由懷化學(xué)院向?qū)O軍副教授鑒定.

1.2 儀器

FY130藥物粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；蛙心插管（成都泰盟科技有限公司）等.

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品

1/5000鹽酸腎上腺素注射液（遠(yuǎn)大醫(yī)藥（中國(guó)）有限公司，批號(hào)：151209）；1/10000乙酰膽堿（博美生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：Sigma A 6625）；0.4 mg/mL硫酸阿托品注射液（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號(hào)：T16F027）；0.1 mg/mL鹽酸普萘洛爾（江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1603084）；0.5 mg/mL鹽酸苯海拉明（臨汾寶珠制藥有限公司，批號(hào)：141001）；0.4 μg/mL 甲磺酸酚妥拉明（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：D160204）；任氏液：參考《藥理學(xué)》[7]配方配制（1 000 mL蒸餾水中NaCl 6.50 g、KCl 0.14 g、CaCl20.12 g、NaHCO30.20 g、NH2PO40.01 g、葡萄糖2 g），所用試劑均為化學(xué)純?cè)噭?

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 葛花醇提液的制備

參考李勝華[8]的浸提方法制備葛花醇提液.將干葛花充分粉碎，60目過篩，取細(xì)小粉末100.0 g，緩慢加入1 000 mL的60%乙醇溶液，邊攪拌邊混勻，保鮮膜密封，浸泡24 h，期間不定時(shí)混勻.利用真空泵將浸提液抽濾，雙層濾紙，抽濾兩次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙醇，濃縮定容至100 mL，得到粗提物濃度即為1.0 g/mL，待完全冷卻后置于冰箱（4～6℃）保存?zhèn)溆?，使用前依次稀釋所需濃?

1.4.2 葛花醇提液對(duì)離體蛙心收縮功能的影響

用斯氏法[9]制備離體蛙心，連接到BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng).記錄正常蛙心自主收縮曲線為對(duì)照.實(shí)驗(yàn)時(shí)，待蛙心收縮曲線穩(wěn)定后將任氏液全部吸出，然后往其中注入一定體積的葛花醇提液，觀察記錄，產(chǎn)生變化后至少穩(wěn)定10-15個(gè)波形，然后吸出全部作用液，再用任氏液徹底灌洗，待波形穩(wěn)定后，再進(jìn)行下一次給藥.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將葛花醇提液作用濃度范圍確定為0.5-50 mg/mL.在有效濃度范圍內(nèi)用同樣方法再確定不同濃度葛花醇提液對(duì)離體蛙心收縮功能的影響.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用區(qū)間測(cè)量法，測(cè)定記錄給藥前和給藥后10個(gè)波形的張力峰值和心率變化情況，并根據(jù)公式計(jì)算張力變化率和頻率變化率，變化率公式如下：

變化率=（葛花醇提液灌流時(shí)的收縮張力或心率-任氏液灌流時(shí)的收縮張力或心率）/葛花醇提液灌流時(shí)的收縮張力或心率×100%

變化率為正值，表示收縮力或心率增加；變化率為負(fù)值，表明收縮力或心率減慢.

1.4.3 葛花醇提液對(duì)加入不同受體阻斷劑后離體蛙心收縮功能的影響

根據(jù)1.4.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取促進(jìn)蛙心收縮作用明顯的葛花醇提液濃度（2.5 mg/mL），參考齊梁煜[10]的方法，分組后分別加入一定濃度和體積的阻斷劑阻斷相應(yīng)的受體后，再加入2.5 mg/mL的葛花醇提液，對(duì)比觀察記錄，探討葛花醇提液對(duì)加入不同受體阻斷劑阻斷相應(yīng)受體后離體蛙心收縮功能的影響.

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）來表示，應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，運(yùn)用Duncan’s復(fù)極差法進(jìn)行組內(nèi)收縮張力差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度葛花醇提液對(duì)離體蛙心收縮力的影響

表1 不同濃度葛花醇提液對(duì)離體蛙心收縮張力的影響（X±SD，n=10）

圖1 不同濃度葛花醇提液對(duì)離體蛙心收縮力的影響

由圖1和表1可知，在正常條件下，離體蛙心收縮正常而穩(wěn)定，給藥后其收縮波形呈現(xiàn)不同程度的變化，添加低濃度（0.5～5.0 mg/mL）的葛花醇提液能有效促進(jìn)離體蛙心收縮，且在2.5 mg/mL時(shí)促進(jìn)作用最顯著（P＜0.01），但在10 mg/mL時(shí)離體蛙心收縮受到抑制，且隨著濃度增高，抑制作用增強(qiáng)，差異極顯著.因此，不同濃度葛花醇提液對(duì)離體蛙心表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)收縮、高濃度抑制收縮，即具有“雙向調(diào)節(jié)”作用.

2.2 不同濃度葛花醇提液對(duì)離體蛙心心率的影響

由表2可知，在正常條件下，離體蛙心收縮穩(wěn)定，給藥后，心肌心率無明顯變化規(guī)律，表明在此濃度范圍內(nèi)的葛花醇提液對(duì)離體蛙心的心率無顯著影響（P＞0.05）.

2.3 葛花醇提液對(duì)加入不同受體阻斷劑后離體蛙心收縮活動(dòng)的影響

根據(jù)表1結(jié)果可知，2.5 mg/mL葛花醇提液可明顯促進(jìn)心肌收縮力，待離體蛙心收縮平穩(wěn)后，分別加入不同的受體阻斷劑：如圖2?，加入硫酸阿托品（M型膽堿能受體阻斷劑）后，收縮幅度顯著降低，在此基礎(chǔ)上，加入2.5 mg/mL葛花醇提液，未見其收縮活動(dòng)明顯增強(qiáng)（P＞0.05），表明M受體阻斷后，葛花醇提液無法正常與M受體結(jié)合導(dǎo)致無法促進(jìn)心肌收縮，推測(cè)葛花醇提液作用可能與阻斷M受體有關(guān)；如圖2?，加入鹽酸苯海拉明（組胺H1受體阻斷劑）后，心肌收縮受到顯著抑制（P＜0.01），再加入葛花醇提液后離體蛙心收縮作用顯著增強(qiáng)（P＜0.05），但收縮波形為不規(guī)則收縮，表明葛花醇提液作用可能與H1受體無關(guān)，在H1受體阻斷后仍能促進(jìn)心肌收縮；如圖2?，同樣方法，在另一個(gè)離體蛙心中加入鹽酸普萘洛爾（β受體阻斷劑）可見離體蛙心收縮受到顯著抑制（P＜0.01），之后加入葛花醇提液，離體蛙心收縮抑制作用逐漸回升（P＜0.05），表明葛花醇提液作用可能與β受體無關(guān)；如圖2?，加入甲磺酸酚妥拉明（α受體阻斷劑）后，收縮幅度顯著降低，同樣方法加入葛花醇提液后，離體蛙心收縮無明顯變化（P＞0.05），沒有表現(xiàn)促進(jìn)作用，表明葛花醇提液作用可能與α受體有關(guān).

表2 不同濃度葛花醇提液對(duì)離體蛙心心率的影響（X±SD，n=10）

圖2 葛花醇提液對(duì)不同阻斷劑阻斷受體后離體蛙心收縮活動(dòng)的影響

3 討論

心臟接受交感、副交感神經(jīng)雙重支配，且支配心臟的各個(gè)部分不對(duì)稱，如右側(cè)交感神經(jīng)興奮時(shí)以增快心率為主，對(duì)心肌收縮力影響不大，而左側(cè)交感神經(jīng)興奮時(shí)以加強(qiáng)心肌收縮力的效應(yīng)為主，對(duì)心率影響不大[11].本研究結(jié)果表明不同濃度的葛花醇提液對(duì)離體蛙心心肌收縮力有明顯的效應(yīng)，對(duì)心率沒有明顯影響，推測(cè)可能是葛花醇提液中有大量活性成分刺激左側(cè)交感神經(jīng)，從而對(duì)蛙心收縮起主導(dǎo)作用.

已有報(bào)道，不同的神經(jīng)通過釋放激素作用于心肌膜上的受體而發(fā)揮作用.隨著免疫組化技術(shù)的不斷進(jìn)步以及研究的不斷深入，越來越多的受體類型被發(fā)現(xiàn)，一種類型受體又分為不同亞型[12].比如心肌膜上的腎上腺素能受體（AR），因與特異性蛋白胨親和性、激動(dòng)后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及生物學(xué)效應(yīng)存在差異性而分為α-AR和β-AR兩型，這兩種類型受體作用機(jī)制存在明顯差異[12，13].本實(shí)驗(yàn)研究表明，分別加入受體阻斷劑甲磺酸酚妥拉明（PM）和鹽酸普萘洛爾后，再加入葛花醇提液，心肌表現(xiàn)存在明顯差異，而PM是腎上腺素能α-AR受體的阻斷劑，鹽酸普萘洛爾是β-AR的阻斷劑，可見葛花醇提液可能是通過與α-AR受體結(jié)合并使之興奮，促使心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位0相上升速率加快，即對(duì)快鈉電流起促進(jìn)作用，使心肌細(xì)胞間傳導(dǎo)加快，心肌細(xì)胞的興奮性增強(qiáng)，從而促進(jìn)心肌收縮[13].

M受體也存在M1、M2多種亞型，不同亞型受體興奮后對(duì)心肌表現(xiàn)為負(fù)性或正性作用[14].當(dāng)加入硫酸阿托品和2.5 mg/mL葛花醇提液時(shí)，心肌收縮沒有顯著增加，可見葛花醇提液無法阻斷毒蕈堿型受體（M受體），從而無法促進(jìn)心肌收縮.推測(cè)可能是由于葛花醇提液中有活性成分通過偶聯(lián)G蛋白，從而降低腺苷酸環(huán)化酶（AC）的活性，進(jìn)而降低cAMP含量，從而促進(jìn)心肌收縮；也可能是直接阻斷毒蕈堿型鉀通道，使K+外流加速，進(jìn)而Ca+內(nèi)流或Na+內(nèi)流造成心肌收縮[15]，具體原因有待于進(jìn)一步研究.