王建國(guó), 趙南南, 何志云, 王 澤

(1.濟(jì)南市歷城區(qū)婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心, 濟(jì)南 250100; 2.沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034)

0 引 言

白假絲酵母菌(Candidaalbicans),又稱白色念珠菌,是念珠菌中致病力最強(qiáng)的條件性致病真菌。目前,由于廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑等藥物的大量使用,以及器官移植和介入性診療技術(shù)的普遍開(kāi)展,白假絲酵母菌已成為醫(yī)院內(nèi)獲得性真菌致病感染的首要原因[1-2]。研究顯示,白假絲酵母菌的分泌蛋白,如天冬氨酸酶、絲氨酸肽酶、胞外磷脂酶B等,與其毒力、對(duì)人體上皮細(xì)胞的粘附、入侵和抑制免疫應(yīng)答等致病行為存在非常重要的聯(lián)系[3-4],已成為白假絲酵母菌相關(guān)疾病治療和預(yù)防的確切靶點(diǎn)[5]。隨著生物信息技術(shù)的長(zhǎng)足發(fā)展,已成為揭示微生物分泌蛋白質(zhì)組及其生物學(xué)作用的最有效技術(shù)手段[6]。因此,本研究根據(jù)已公布的白假絲酵母菌的全基因組信息,對(duì)其分泌蛋白及其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和初步分析,為全面解析白假絲酵母菌致病機(jī)理提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

白假絲酵母菌(WO-1)全基因組的6170個(gè)ORF序列來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2 方 法

采用軟件SignalP v 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)白假絲酵母菌WO-1全基因組蛋白的N端是否存在信號(hào)肽和酶切位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析;TMHMM server v 2.0軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和 Phobius軟件(http:∥phobius.sbc.su.se/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列跨膜區(qū)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和數(shù)量;TargetP 1.1軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預(yù)測(cè)靶標(biāo)肽段在亞細(xì)胞器的定位,確定是否為穿膜信號(hào)肽;Big-PI Fungal Predictor v 3.1(http:∥mendel.imp.ac.at/gpi/cgi-bin/gpi_pred_fungi.cgi)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)氨基酸序列是否存在GPI錨定位點(diǎn)。符合以下四項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的序列即為目標(biāo)分泌蛋白: 1)含有1個(gè)N端信號(hào)肽; 2)不含跨膜區(qū); 3)沒(méi)有線粒體或其他胞內(nèi)細(xì)胞器靶定蛋白的信號(hào)域; 4)沒(méi)有GPI錨定位點(diǎn)。同時(shí)利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot(http:∥www.uniprot.org/),NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Candida Genome Database(http:∥www.candidagenome.org/)對(duì)預(yù)測(cè)的分泌蛋白及其信號(hào)肽進(jìn)行檢索與驗(yàn)證分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白假絲酵母菌分泌蛋白的預(yù)測(cè)

2.1.1 信號(hào)肽分析

通過(guò)SignalP v 4.1軟件對(duì)信號(hào)肽及酶切位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別,最終得到376個(gè)含N端信號(hào)肽的ORFs,占全基因組蛋白序列的6.07%。

2.1.2 膜結(jié)合蛋白分析

采用TMHMM軟件和Phobius軟件對(duì)含信號(hào)肽的氨基酸序列進(jìn)行跨膜域的區(qū)分,分辨分泌蛋白和跨膜蛋白。TMHMM軟件分析結(jié)果顯示,376個(gè)具信號(hào)肽的蛋白中: 1)含2個(gè)及以上跨膜區(qū)的有52個(gè),提示該部分蛋白可能作為膜受體,錨定蛋白或者離子通道蛋白; 2)66個(gè)含有一個(gè)跨膜區(qū); 3)258個(gè)無(wú)跨膜區(qū)。利用Phobius軟件對(duì)篩選的66個(gè)具有1個(gè)跨膜區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證,結(jié)果顯示,66個(gè)氨基酸序列中有23個(gè)不含跨膜區(qū)。最終得到了281個(gè)不含跨膜區(qū),且具有分泌信號(hào)肽的氨基酸序列。

2.1.3 亞細(xì)胞定位分析

利用TargetP 1.1軟件識(shí)別待測(cè)序列N端前導(dǎo)鏈中線粒體的靶標(biāo)肽段(mTP)、葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽段(mTP)等細(xì)胞器的靶向序列,對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行去向定位分析,運(yùn)算結(jié)果最終得到279個(gè)蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽分泌途徑。

2.1.4 錨定位點(diǎn)分析

真核生物蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾中,GPI錨定比較常見(jiàn),保證蛋白質(zhì)能夠錨定在細(xì)胞膜上。具有分泌信號(hào)肽的蛋白質(zhì)如果存在著GPI錨定位點(diǎn),將不能分泌到細(xì)胞外。利用big-PI Fungal Predictor軟件識(shí)別出待測(cè)氨基酸序列的GPI錨定位點(diǎn),從而將這些蛋白排除,最終得到216個(gè)符合目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸序列。

2.2 分泌蛋白的特征分析

白假絲酵母菌(WO-1)基因組的6170個(gè)ORF序列共甄選出分泌蛋白216個(gè),占ORF總數(shù)的3.50%。最長(zhǎng)的氨基酸序列具有1447個(gè)氨基酸,均值是762,主要集中在401～500個(gè)氨基酸區(qū)段(見(jiàn)圖1)。經(jīng)過(guò)對(duì)已公布的白假絲酵母菌數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)分析,預(yù)測(cè)的分泌蛋白組中31.9%明確注釋了細(xì)胞外定位,33.33%的氨基酸序列未注釋定位。同時(shí),也存在細(xì)胞壁、膜泡、線粒體、質(zhì)膜等位置的平行注釋(見(jiàn)圖2)?？蓹z索到生物學(xué)功能124個(gè),其中具有水解酶活性的蛋白最多,占11.57%,依次為水解酶活性、肽鏈內(nèi)切酶活性、脂肪酶活性、金屬離子結(jié)合活性、致病原、細(xì)胞壁形成、催化活性、針對(duì)藥物、饑餓或者溫度的細(xì)胞應(yīng)答及轉(zhuǎn)移酶活性等(見(jiàn)圖3),同時(shí)存在40.28%的預(yù)測(cè)序列并未注釋功能。

圖1 預(yù)測(cè)的分泌蛋白ORFs長(zhǎng)度

圖2 預(yù)測(cè)的分泌蛋白細(xì)胞定位分布

圖3 分泌蛋白的注釋功能分析

2.3 分泌蛋白信號(hào)肽的特征分析

預(yù)測(cè)的分泌蛋白信號(hào)肽長(zhǎng)度介于12～33個(gè)氨基酸殘基(見(jiàn)圖4),其中具有18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽數(shù)量最多。信號(hào)肽中非極性及疏水氨基酸(A、V、L、G、I、P)組成出現(xiàn)頻率為52.88%,帶負(fù)電荷的酸性氨基酸(D、E)占1.26%,帶正電荷的堿性氨基酸(K、R、H)為5.30%,芳香族氨基酸(W、F、Y)占11.64%,其中亮氨酸(L)出現(xiàn)頻率最高,為20.51%。信號(hào)肽C端切割位點(diǎn)前后-3～+3氨基酸組成對(duì)信號(hào)肽的識(shí)別具有重要作用,氨基酸分布數(shù)量最多的是丙氨酸(A),在-1位出現(xiàn)頻率最高,為60.65%,僅-3位和+2位所有氨基酸均出現(xiàn)(見(jiàn)表1)。

圖4 預(yù)測(cè)的分泌蛋白信號(hào)肽長(zhǎng)度分析

表1 預(yù)測(cè)的分泌蛋白信號(hào)肽氨基酸組成和分布頻率

3 討 論

白假絲酵母菌WO-1可以侵犯人體許多部位,如皮膚、粘膜,甚至引起內(nèi)臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或全身感染,臨床癥狀錯(cuò)綜復(fù)雜[7-8]。白假絲酵母菌的分泌蛋白在其致病力、侵染性及感染后癥狀等多種惡性生物行為方面起到了決定性作用。本實(shí)驗(yàn)基于白假絲酵母菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息,利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)算法尋找潛在的白假絲酵母菌分泌蛋白,為更好的破解和阻遏白假絲酵母致病威脅提供有效的數(shù)據(jù)支持。

2001年斯坦福大學(xué)首次公布白假絲酵母菌SC5314的全基因組序列(http:∥www-sequence.stanford.edu/group/candida)[9],Samuel等對(duì)白假絲酵母菌SC5314(6165ORF)的分泌蛋白組進(jìn)行了分析與預(yù)測(cè),并得到283個(gè)分泌蛋白[10]。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),WO-1與SC5314分泌蛋白的信號(hào)肽特征及各氨基酸使用頻率大體一致,長(zhǎng)度多集中在18～21,以亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)和異亮氨酸(I)的組成為主,WO-1信號(hào)肽切割位點(diǎn)的-3～+3位上20種氨基酸使用頻率具有很高的多態(tài)性,A(丙氨酸)使用頻率最高的為-1,同時(shí)切割位點(diǎn)相對(duì)不保守,這一現(xiàn)象在其他微生物分泌蛋白中比較常見(jiàn)[11-12]。SC5314 和 WO-1是白假絲酵母菌的兩個(gè)亞種,SC5314具有很低的致病性,因此,除去分析軟件的影響,分泌蛋白數(shù)量上的差異在不同程度上顯示了WO-1與SC5314的生物學(xué)特征和功能存在本質(zhì)性的差別。

本文對(duì)WO-1的216個(gè)分泌蛋白進(jìn)行詳細(xì)的功能檢索和分析,預(yù)測(cè)的分泌蛋白中以水解酶活性蛋白居多,主要包括分泌型天冬氨酸酶、磷脂酶、脂肪酶、分泌絲氨酸肽酶以及α-葡萄糖苷酶等,同時(shí),廣泛的涉及到肽鏈內(nèi)切酶活性、脂肪酶活性、金屬離子結(jié)合活性、細(xì)胞壁的形成等生物學(xué)功能,甚至參與了針對(duì)藥物,饑餓或者溫度的細(xì)胞耐受和應(yīng)答過(guò)程,說(shuō)明分泌蛋白可能參與了白假絲酵母菌致病的多個(gè)生物學(xué)環(huán)節(jié)。值得注意的是,預(yù)測(cè)的分泌蛋白質(zhì)組中近1/3的成員為未注釋功能的蛋白,為我們深入挖掘和理解白假絲酵母菌致病機(jī)理等提供了巨大參考數(shù)據(jù)。生物技術(shù)和算法的發(fā)展,也將為白假絲酵母菌致病機(jī)制的深入研究提供更有效的支撐。