劉 鵬，白意曉

(閬中市人民醫(yī)院胃腸外科，四川 閬中 637400)

胃癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率居于我國惡性腫瘤的首位，死亡率分別居于我國城市和農(nóng)村惡性腫瘤的第2位和第1位[1]。目前胃癌的治療以手術(shù)、放化療等綜合治療手段為主，多數(shù)患者就診時已進(jìn)入中晚期，治療效果并不滿意[2]。因此，了解胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的生物標(biāo)記物或基因治療靶點(diǎn)，對于胃癌的診療有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)在細(xì)胞周期、分化、發(fā)育等多種生物學(xué)進(jìn)程中有重要作用，成為近年來腫瘤治療靶點(diǎn)研究的熱點(diǎn)[3]。miR-29a 作為miRNA 家族成員已被證實在胰腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中呈低表達(dá)或不表達(dá)，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移[4-5]。前期研究中通過檢測胃癌根治術(shù)后患者胃癌組織及癌旁組織miR-29a 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-29a 在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，提示miR-29a 的表達(dá)下調(diào)可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，在包括胃癌的許多實體瘤中發(fā)現(xiàn)其蛋白的組成型激活具有普遍的促炎致癌特征[6]。故此，本研究探討miR-29a 對人胃癌細(xì)胞增殖、遷移的影響及對STAT3的作用，初步解釋其調(diào)控機(jī)制，以期為今后胃癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

0.25%胰蛋白酶、RPMI 1640 培養(yǎng)液，均購于武漢普諾賽生命科技有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于濟(jì)南源茂化工有限公司；Trizol RNA 抽提試劑、 熒光素酶檢測試劑盒、LipofectamineTM3000 陽離子脂質(zhì)體購于美國Invitrogen公司；siRNA 片段購于上海基屹生物科技有限公司；化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(electrochemiluminescence，ECL)購于北京莊盟國際生物基因科技公司；蛋白定量BCA試劑盒購于美國Pierce 公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HER)標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體，兔抗鼠IgG 抗體購于美國Santa Cruz 公司；STAT3、 磷 酸 化STAT3(phosphorylated-STAT3， p-STAT3)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、U6 抗體、βactin 抗體購于美國Sigma 公司。Mx 3005P 熒光定量PCR儀購于美國Agilent公司，GelDoc-It 310凝膠成像系統(tǒng)購于美國UVP公司，-80 ℃低溫冰箱購于濟(jì)南卓隆生物科技有限公司，Tecan-5082 Sunrise 全自動酶標(biāo)儀購于奧地利TECAN公司，徠卡生物倒置顯微鏡購于德國Leica公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌SGC-7901 細(xì)胞株，購于上海生命科學(xué)院細(xì)胞所，采用含10%胎牛血清、青/鏈雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組Has-miR-29a 模擬物(mimics)根據(jù)miR-29a成熟體序列(miRBase數(shù)據(jù)庫檢索序列信息)合成，正義鏈5′-AUUGCGUAGAGAUUCA AGCUCUG-3′；反義鏈5′-ACUAGGUUAACGAUCGG UAGCUA-3′，陰性對照siRNA為與目的基因的序列無同源性的普通陰性對照，以上由上海吉瑪公司合成。依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000 說明書步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前24 h 取對數(shù)生長期人胃癌SGC-7901細(xì)胞按1.0×105個/孔接種于6孔板，使細(xì)胞轉(zhuǎn)染時底面覆蓋率達(dá)50%～70%。125 μL 無血清抗生素的RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋9 μL miRNA mimics 及對照質(zhì)粒，EP 管中加入5 μL LipofectamineTM3000，輕柔吹吸數(shù)次混勻，室溫靜置5 min。吸去培養(yǎng)液，每孔依次加入500 μL 無抗生素含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液，后加入上述轉(zhuǎn)染物，混勻，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染6 h 后更換新鮮RPMI 1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。miR-29a 過表達(dá)實驗分為miR-29a轉(zhuǎn)染組、質(zhì)粒對照組、空白對照組，miR-29a 轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染has-miR-29a mimics 質(zhì)粒，質(zhì)粒對照組轉(zhuǎn)染siRNA對照質(zhì)粒，未經(jīng)處理的人胃癌SGC-7901細(xì)胞為空白對照組。STAT3 下調(diào)實驗分為空白對照組和STAT3 抑制組，STAT3 抑制組細(xì)胞在底面覆蓋率達(dá)50%～70%時加入STAT3 抑制劑溶液12.25 μL，空白對照組為未經(jīng)處理的人胃癌SGC-7901 細(xì)胞。以上實驗每組均設(shè)2個復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.2 qPCR 檢測人胃癌SGC-7901 細(xì)胞miR-29a、VEGF、STAT3、cyclin D1 mRNA 表達(dá)取miR-29a轉(zhuǎn)染及STAT3抑制劑處理48 h后細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以U6及β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測目的基因，擴(kuò)增引物序列由上海生工合成，序列如下：miR-29a，上游5′-ATGCACCTT CGAGCATTGT-3′，下 游5′-TGTGCGTGTCTATATAC GA-3′；VEGF，上游5′-ATGCTTCTGAAGTTGGGAT CT-3′，下游5′-TAGCATCGATCTATGATAGTCA-3′；STAT3，上游5′-TCTCTGACTAGGCTGAGTGATT-3′，下 游5′-CTATACTCAGATACTTGCGCTA-3′；cyclin D1，上游5′-AGTGGATTAAGTGGAGTGAGC-3′，下游5′-ACTGATACAAGTTGATCCGATG-3′；U6，上游5′-GTGCGTCTACGGTTCTGGA-3′，下游5′-CTGCAT GATAGCGACGATTC-3′；β-actin，上游5′-AGGTGA CTGTGCTAGAGTG-3′，下游5′-TAAGTTATGGAGAT GGACGA-3′。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行qPCR 分析，反應(yīng)采用20 μL 體系：2×濃縮的qPCR 擴(kuò)增預(yù)混合溶液10 μL，10 mol/L 上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，雙蒸餾水 7 μL 混勻；反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃、20 s，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃延伸3 min，使用2-ΔΔCT法表示目的mRNA的相對表達(dá)水平。

1.3.3 Western blot 檢 測 及VEGF、STAT3、p-STAT3、cyclin D1 蛋白表達(dá)情況取miR-29a 轉(zhuǎn)染及STAT3抑制劑處理48 h后細(xì)胞，經(jīng)SDS裂解液裂解后提取總蛋白，BCA試劑盒測定其蛋白濃度，常規(guī)行SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，經(jīng)TBST 洗滌液洗滌后，分別加入VEGF、βactin 抗體(1∶1 000 稀釋)，4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶8 000 稀釋)，ECL 試劑盒顯色，以ImageJ 軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值比值為相對表達(dá)水平。

1.3.4 MTT實驗檢測細(xì)胞增殖情況取miR-29a轉(zhuǎn)染及STAT3抑制劑處理48 h后細(xì)胞，胰蛋白酶消化后接種于96 孔板，2.0×103個/孔，每組6 個復(fù)孔，在培養(yǎng)24、48、72 h 時每孔分別加入MTT 溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄培養(yǎng)液，加入DMSO 溶液150 μL，輕柔吹吸使其充分溶解，以酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm波長處的光密度D(490)值。

細(xì)胞相對增殖率=D(490)實驗組/D(490)空白對照組×100%

1.3.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移情況取miR-29a轉(zhuǎn)染及STAT3 抑制劑處理48 h 后對數(shù)生長期人胃癌SGC-7901 細(xì)胞，接種于96 孔板，2.0×103個/孔，細(xì)胞長滿單層后，棄去培養(yǎng)基，使用移液槍頭在培養(yǎng)板底部劃一直線，PBS 輕柔吹洗，保持邊緣整齊，每孔依次加入DMEM 培養(yǎng)液(不含胎牛血清)，劃痕后即刻(0 h)及24 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移情況，測量劃痕寬度(l)。

遷移率=(l0h-l24h)/l0h×100%

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，以xˉ±s表示計量資料，空白對照組、質(zhì)粒對照組、miR-29a轉(zhuǎn)染組的mRNA、蛋白表達(dá)、細(xì)胞相對增殖率及遷移率的比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用t檢驗LSD 法?？瞻讓φ战M與STAT3 抑制組的mRNA、蛋白表達(dá)、細(xì)胞相對增殖率及增殖率比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-29a、VEGF、STAT3、cyclin D1 mRNA表達(dá)情況比較

qPCR 實驗結(jié)果見表1。miR-29a 轉(zhuǎn)染后，空白對照組、質(zhì)粒對照組、miR-29a 轉(zhuǎn)染組的STAT3 mRNA相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；與空白對照組、質(zhì)粒對照組比較，miR-29a 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的miR-29a 相對表達(dá)水平升高，VEGF、cyclin D1 mRNA 相對表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；空白對照組細(xì)胞的miR-29a、VEGF 及cyclin D1 mRNA 相對表達(dá)水平與質(zhì)粒對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 miR-29a，VEGF、STAT3、cyclin D1 mRNA 相對表達(dá)水平比較(n=3，s)

表1 miR-29a，VEGF、STAT3、cyclin D1 mRNA 相對表達(dá)水平比較(n=3，s)

與空白對照組比較，*P＜0.01；與質(zhì)粒對照組比較，#P＜0.01.

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2.2 VEGF、STAT3、cyclin D1蛋白表達(dá)情況比較

Western blot 實驗結(jié)果見圖1 和表2。miR-29a 轉(zhuǎn)染后，與空白對照組、質(zhì)粒對照組比較，miR-29a 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的VEGF、cyclin D1 蛋白相對表達(dá)水平及p-STAT3/STAT3 下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；空白對照組與質(zhì)粒對照組細(xì)胞的VEGF、cyclin D1 蛋白相對表達(dá)水平及p-STAT3/STAT3比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 MTT實驗結(jié)果

MTT 實驗的結(jié)果見表3。miR-29a 轉(zhuǎn)染后，空白對照組、質(zhì)粒對照組與miR-29a 轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后24、48、72 h的細(xì)胞相對增殖率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；與空白對照組和質(zhì)粒對照組比較，miR-29a轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24、48、72 h的細(xì)胞相對增殖率更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；空白對照組與質(zhì)粒對照組轉(zhuǎn)染24、48、72 h的細(xì)胞相對增殖率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 Western blot檢測結(jié)果

表2 VEGF、STAT3、cyclin D1蛋白表達(dá)水平比較(n=3，x±s)

表3 各組人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖情況比較(n=3，s，%)

表3 各組人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖情況比較(n=3，s，%)

空白對照組比較，*P＜0.01；與質(zhì)粒對照組比較，#P＜0.01.

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2.4 細(xì)胞的遷移率比較

劃痕實驗的結(jié)果見圖2。miR-29a轉(zhuǎn)染后，空白對照組、質(zhì)粒對照組、miR-29a 轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移率分別為(65.32±12.33)%、(67.20±11.58)%、(28.59±8.52)%，與空白對照組和質(zhì)粒對照組比較，miR-29a 轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移率更低(均為P＜0.01)，空白對照組與質(zhì)粒對照組細(xì)胞遷移率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.779，P=0.438)。

圖2 細(xì)胞遷移劃痕實驗結(jié)果

2.5 STAT3 下調(diào)對STAT3、cyclin D1 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響

Western blot 和qPCR 實 驗 結(jié) 果 見 圖3 和 表4。STAT3 抑制劑處理細(xì)胞后，與空白對照組比較，STAT3 抑制組細(xì)胞cyclin D1 mRNA 及蛋白相對表達(dá)水平、p-STAT3/STAT3 下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，空白對照組與STAT3抑制組細(xì)胞STAT3 mRNA相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖3 Western blot檢測結(jié)果

表4 STAT3下調(diào)對STAT3、cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響(n=3，s)

表4 STAT3下調(diào)對STAT3、cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響(n=3，s)

與空白對照組比較，*P＜0.01.

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2.6 STAT3 下調(diào)對人胃癌SGC-7901 細(xì)胞增殖的影響

MTT 實驗的結(jié)果見表5。STAT3 抑制劑處理細(xì)胞后，與空白對照組比較，STAT3抑制組24、48、72 h的細(xì)胞相對增殖率均更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表5 STAT3下調(diào)對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響(n=3，，%)

表5 STAT3下調(diào)對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響(n=3，，%)

與空白對照組比較，*P＜0.01.

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2.7 STAT3 下調(diào)對人胃癌SGC-7901 細(xì)胞遷移的影響

劃痕實驗的結(jié)果見圖4。STAT3 抑制劑處理細(xì)胞后，STAT3 抑制組的細(xì)胞遷移率為(33.52±7.80)%，低于空白對照組的(60.52±10.05)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.199，P＜0.01)。

3 討 論

胃癌的發(fā)病原因與遺傳、環(huán)境、飲食、幽門螺桿菌感染等多因素密切相關(guān)，其具體發(fā)病機(jī)制仍未明確[7]。發(fā)病早期無典型癥狀，容易被忽視，早期診斷率較低。晚期有并發(fā)癥及轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)梗阻、惡心嘔吐、進(jìn)食困難、消化道出血、捫及包塊、貧血等癥狀，預(yù)后較差，具有較高的死亡率。癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移是治療后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵，也是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[8]。癌細(xì)胞生長周期失衡是腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制，這一過程涉及抑癌與致癌相關(guān)基因的突變、原癌基因的激活及細(xì)胞調(diào)節(jié)周期基因功能的改變等多種機(jī)制[9]。因此，了解相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制，對于尋找有效的靶向治療藥物，改善患者的預(yù)后有重要意義。

圖4 細(xì)胞遷移劃痕實驗結(jié)果

miRNA 是具有廣泛基因調(diào)控作用的小分子RNA，能夠調(diào)控靶基因mRNA 轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)行為[10]。Zhang 等[11]認(rèn)為，胃癌存在多種miRNA 分子的異常表達(dá)，且其增殖、凋亡等生物學(xué)行為與miRNA分子密切相關(guān)。miR-29a是miRNA 家族的重要成員，在生物體中具有抑癌作用，能解除相關(guān)靶基因表達(dá)的抑制作用，使靶基因表達(dá)失調(diào)，對細(xì)胞的生成生物學(xué)功能產(chǎn)生影響[12]。癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移與新血管的生成密不可分。VEGF 是具有高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，能在低氧環(huán)境下與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的VEGF 受體結(jié)合，激活有絲分裂原活化蛋白激酶，促進(jìn)VEGF的有絲分裂，誘導(dǎo)血管細(xì)胞的增生，促進(jìn)腫瘤血管和淋巴管的生成，為腫瘤細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移提供條件[13]。本研究結(jié)果顯示，miR-29a 轉(zhuǎn)染后，與空白對照組和質(zhì)粒對照組比較，miR-29a 轉(zhuǎn)染組的miR-29a相對表達(dá)水平升高，VEGF mRNA 與蛋白相對表達(dá)水平均下降，說明miR-29a 可抑制VEGF mRNA 和蛋白的表達(dá)。此外MTT實驗結(jié)果顯示，與空白對照組和質(zhì)粒對照組比較，miR-29a 轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后24、48、72 h的細(xì)胞相對增殖率降低；劃痕實驗中，與空白對照組和質(zhì)粒對照組比較，miR-29a 轉(zhuǎn)染組的遷移率降低，提示miR-29可能通過抑制VEGF的表達(dá)影響人胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。

細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。STAT3 是腫瘤細(xì)胞重要信號調(diào)控蛋白，具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄雙重功能，經(jīng)活化后參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等細(xì)胞周期的調(diào)控[14]。研究[15]顯示，活化的STAT3分子能對目標(biāo)靶基因的表達(dá)發(fā)揮持續(xù)調(diào)控作用，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化與腫瘤的發(fā)生。Cyclin D1 是STAT3 細(xì)胞信號傳導(dǎo)的下游分子，能調(diào)控G1/S期過渡檢查點(diǎn)，參與細(xì)胞周期的精準(zhǔn)調(diào)控，維持細(xì)胞正常的生長發(fā)育，Cyclin D1基因的改變，可導(dǎo)致細(xì)胞周期的異常改變，促進(jìn)細(xì)胞癌變[16]。研究[17]認(rèn)為，CXC 受體4 能調(diào)控STST3 信號通路介導(dǎo)下游靶基因Cyclin D1的表達(dá)，影響細(xì)胞的生長、凋亡。劉彬等[18]證實，抑制非小細(xì)胞肺癌血管內(nèi)皮生長因子受體2，旁路活化的STAT-3可直接或間接調(diào)控Cyclin D1的表達(dá)，增強(qiáng)放療敏感性。本研究結(jié)果中，過表達(dá)實驗中miR-29a 轉(zhuǎn)染后，與空白對照組和質(zhì)粒對照組比較，miR-29a轉(zhuǎn)染組的p-STAT3/STAT3與cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)降低；STAT3 下調(diào)實驗中，應(yīng)用STAT3 抑制劑后，STAT3 抑制組的cyclin D1 mRNA 及蛋白相對表達(dá)水平、p-STAT3/STAT3、不同時刻MTT 實驗相對增殖率與細(xì)胞遷移率均低于空白對照組，提示miR-29a 可通過下調(diào)p-STAT3蛋白、cyclin D1 mRNA 及蛋白的表達(dá)，影響胃癌的增殖與遷移。

綜上所述，miR-29a 能負(fù)調(diào)節(jié)VEGF 的表達(dá)，影響人胃癌細(xì)胞的增殖與遷移，其機(jī)制可能與抑制STAT3 蛋白磷酸化及cyclin D1 mRNA 與蛋白的表達(dá)有關(guān)。在今后的研究中，可將miR-29a 作為胃癌基因靶向治療的參考靶標(biāo)。