江蕾微

（貴州省人民醫(yī)院 貴州 貴陽(yáng) 550001）

人羊膜上皮細(xì)胞（hAECs）是一種較為特殊的細(xì)胞，其擁有與常規(guī)干細(xì)胞相似的特征，與其他干細(xì)胞相比具有較全面的多分化潛能等多方面優(yōu)點(diǎn)，可將其作為本次研究的種子細(xì)胞來進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。去表皮真皮組織（DED）因其保留原人體皮膚組織糖胺多糖和蛋白質(zhì)等等基膜成分，能夠像正常皮膚細(xì)胞一樣誘導(dǎo)種子細(xì)胞的分化和增殖，對(duì)組織工程技術(shù)具有較大的應(yīng)用價(jià)值[1]。為研究hAECs 構(gòu)建組織工程皮膚的效果及其性狀，本院將該細(xì)胞植入DED中，并應(yīng)用氣-液界面培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。其研究成果如下：

1.材料與方法

1.1 選用材料

培養(yǎng)基DMEM （美國(guó)Gibco 生物公司），胎牛血清（美國(guó)Hyelone 生物公司），表皮生長(zhǎng)因子（EGF，美國(guó)PeproTech 生物公司），波形蛋白抗體（Denmark 生物公司），層粘蛋白抗體（DAKO,Denmark），試劑盒（晶美生物工程有限公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司），熒光顯微鏡與倒置生物顯微鏡（Olympus公司），臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，TDL-40B 型）。

1.2 方法

首先需制備hAECs 的懸液，制備具體流程為：在新生兒家屬同意下，應(yīng)用機(jī)械剝離方式剝離新生兒新鮮胎盤上胎盤羊膜組織，應(yīng)用低濃度胰蛋白酶分離以上hAECs。將胎盤上提取的羊膜組織用磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行清洗，剪成細(xì)小碎塊后加入0.25%胰蛋白酶，按照同一方向輕輕搖晃培養(yǎng)容器，以收集并消化貼附與容器壁的細(xì)胞，收集單細(xì)胞懸液，加10%胎牛血清的培養(yǎng)基停止上述步驟。將殘存于培養(yǎng)容器壁上的細(xì)胞進(jìn)行吹打，調(diào)整離心機(jī)至1000r/min，5min 來分離收集到的細(xì)胞組織。根據(jù)離心后的分層去除上清液，將剩余細(xì)胞置于hAECs 完全培養(yǎng)基中制成完整的懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/ml，待用。

后制備成纖維（FB）細(xì)胞懸液，制備流程為：收集健康未成年男性正常包皮組織后進(jìn)行培養(yǎng)，期間運(yùn)用PBS 液清洗2 ～3遍。加入0.25%胰蛋白酶，按照同一方向輕輕搖晃培養(yǎng)容器，以收集并消化貼附與容器壁的細(xì)胞，加入含8%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基停止上述步驟。將殘存于培養(yǎng)容器壁上的細(xì)胞進(jìn)行吹打，調(diào)整離心機(jī)至1000r/min，5min 來分離收集到的細(xì)胞組織。根據(jù)離心后的分層去除上清液，將剩余細(xì)胞置于含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中制成細(xì)胞完整的懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/ml，待用。

兩種懸液制備完成后，可構(gòu)建組織工程皮膚，具體流程為：將DED 基膜面朝上置于六孔板中，按1mL/孔的劑量加入hAECs的培養(yǎng)基，并將100uL/孔劑量的FB 細(xì)胞懸液按照順序接種于前5 孔中，確保能與后面加入的hAECs 懸液有效反應(yīng)，最后1 孔植入PBS 作為對(duì)照組。將六孔板植入5%CO2，36.7℃的環(huán)境下，以保證Fb 細(xì)胞能夠緊密貼合在DED 真皮面上。放置一夜后翻轉(zhuǎn)DED 至基底膜朝上，用與FB 細(xì)胞懸液相同用量的hAECs 懸液加入已加入FB懸液的孔洞中，后每將hAECs完全培養(yǎng)基加入6個(gè)孔，直到能剛好浸沒DED 為止，將得到的樣本置于CO2濃度為5%、36.7℃環(huán)境中進(jìn)行為期3 ～4 天的培養(yǎng)，使得hAECs 與DED 融合。調(diào)整用于DED 中細(xì)胞組織生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的量，保證hAECs 在液面狀態(tài)的情況下與空氣接觸，應(yīng)用氣-液面培養(yǎng)2 周時(shí)間。

2.結(jié)果

應(yīng)用氣-液面培養(yǎng)2 周后肉眼觀察到DED 上出現(xiàn)明顯膜狀物，且該膜質(zhì)地較光滑。并通過光鏡清晰可見DED 上出現(xiàn)5 ～8層新生表皮結(jié)構(gòu)，且層次、角質(zhì)層分明，表皮突以乳頭狀的形式深入真皮層，且伸入的情況長(zhǎng)短不一。經(jīng)PAS 染色，能清晰觀察到上皮細(xì)胞與DED 表面之間出現(xiàn)了一條平穩(wěn)的紫紅色分界線，此時(shí)檢查 樣本PAS 為陽(yáng)性。應(yīng)用透射電鏡檢測(cè)樣本皮膚組織的結(jié)構(gòu)能得出，該樣本組織與人類皮膚組織結(jié)構(gòu)相似，在其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可明顯觀察到線粒體和角蛋白細(xì)絲等結(jié)構(gòu),兩相鄰細(xì)胞的細(xì)胞膜上出現(xiàn)與一般人體皮膚組織結(jié)構(gòu)相似的細(xì)胞橋粒結(jié)構(gòu)。新生表皮與DED 之間可見基底膜結(jié)構(gòu)，且致密層和透明層清晰可見，同時(shí)在DED 基膜處進(jìn)表皮一側(cè)能觀測(cè)到半橋粒結(jié)構(gòu)。

3.討論

通過以上研究可知，通過將hAECs 懸液接種于DED 中并應(yīng)用氣-液界面等方式在與常人內(nèi)環(huán)境相似的場(chǎng)所進(jìn)行培養(yǎng)，于2周后DED 上明顯趨于平滑，且有一層明顯的膜狀物，該膜狀物便是hAECs 通過增殖與分化轉(zhuǎn)化而來的新生表皮結(jié)構(gòu)，同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可明顯觀察到線粒體和角蛋白細(xì)絲等結(jié)構(gòu),在相鄰的細(xì)胞膜上可見細(xì)胞橋粒結(jié)構(gòu)。這證明經(jīng)hAECs 形成的膜結(jié)構(gòu)與DED 原組織的結(jié)構(gòu)相似。

綜上所述，通過將hAECs 植入DED 中能夠培養(yǎng)出與正常人體皮膚結(jié)構(gòu)作用功能、甚至增殖及分化標(biāo)記分子相似的組織工程皮膚，可將該類細(xì)胞進(jìn)一步研究，有利于未來對(duì)人類皮膚缺失的修復(fù)治療[2-3]。