徐芳 王愛利 黃鶯

特發(fā)性肺纖維化( idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)主要病理特征是成纖維細胞(fibroblast,Fb)過度增殖和細胞外基質(zhì)( extracellularmatrix，ECM) 的大量沉積[1]，其中FB的激活及轉(zhuǎn)化為特異性表達平滑肌a-肌動蛋白(a-smooth muscle actin，a-SMA)的肌成纖維細胞(myofibroblast，MFb)是重要的病理機制[2]，這種表型轉(zhuǎn)化受多種細胞因子和信號通路調(diào)控。本課題組前期研究顯示發(fā)現(xiàn)于炎癥區(qū)域分子1(Found in inflammatory zone 1, FIZZ1)在肺纖維化中有高表達[3]。NOTCH信號通路(NOTCH signaling pathway)能夠調(diào)控細胞分化、增殖及凋亡，參與器官纖維化，在肺纖維化中表達增高[4]。兩者是否互相影響相互促進尚不清楚。本課題研究用NOTCH通路抑制劑即γ-分泌酶抑制劑(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester, DAPT)干預此表型轉(zhuǎn)化過程，觀察FIZZ1、NOTCH1對a-SMA的表達的影響，探討肺間質(zhì)纖維化的分子機制。

資料與方法

一、實驗細胞及儀器試劑

人胚肺成纖維細HELF株(中科院上海生命科學研究院細胞資源中心 )。DAPT(美國Sigma公司)，F(xiàn)IZZ1重組蛋白(美國Santa crue公司)、鼠a-平滑肌肌動蛋白抗體(美國Santa crue公司)、NOTCH1抗體(美國Santa crue公司)，CCK8 試劑盒(日本同仁公司)，Quantscript RT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)，SYBRGreen/Floursecein試劑盒(立陶宛Fermentas公司)。RT-PCR反應(yīng)體系中的引物設(shè)計(武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司)。

二、肺成纖維細胞的培養(yǎng)與傳代

常規(guī)復蘇HELF細胞后，在含10%胎牛血清( fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、50mL/L CO2的條件下培養(yǎng)。當培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞生長達90%匯合度時，吸棄培養(yǎng)基用PBS緩沖液潤洗一次，加入1%胰蛋白酶消化，置于細胞培養(yǎng)箱3min，至細胞變圓脫落，加入等量DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化。利用膠頭滴管反復、緩慢、輕柔吹打，制成細胞懸液，1 000r/min，離心5 min后棄除上清。加入培養(yǎng)液，將所得HELF制成細胞懸液，分瓶傳代，取對數(shù)生長狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。

三、CCK8實驗檢測FIZZ1刺激后細胞增殖活性

將呈對數(shù)生長的細胞取出，制成單細胞懸液接種于96 孔板內(nèi)，每孔100ul(細胞濃度約每毫升含1×105～2×105個細胞)，然后加入100ul培養(yǎng)液，37℃、50mL/L CO2繼續(xù)孵育，貼壁4小時。棄掉舊的培養(yǎng)液，根據(jù)加入FIZZ1濃度分組：分別加入不同濃度的FIZZ1(0.25ug/mL,0.5 ug/mL,1ug/mL,2ug/mL)，空白組(無血清DMEM)，處理24小時后，吸棄孔中培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗滌2次，每孔分別加入10% CCK8試劑培養(yǎng)基，混勻，放入 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，測定波長490nm處各組吸光度值(OD值)，計算增值率。細胞增值率=實驗組OD值/空白組OD值×100%。根據(jù)細胞形態(tài)及增殖率確定FIZZ1最佳實驗濃度做以下實驗。

四、觀察DAPT對FIZZ1誘導HELF細胞增殖的抑制作用

將細胞重新分組：空白組、FIZZ1組、DAPT干預組。DAPT干預組分別加入不同濃度的DAPT(0.25umol/L，0.5umol/L)預處理4小時，空白組及FIZZ1組用無血清DMEM代替。除空白組外余下各組再加入最佳濃度的FIZZ1處理24小時，計算OD值，并確定DAPT的最佳實驗濃度做以下實驗。

五、實時熒光定量PCR測定肺成纖維細胞a-SMA、NOTCH的表達

將細胞分成3組，分別按上述實驗結(jié)果加入相應(yīng)濃度含不同因子的培養(yǎng)基：對照組(無血清培養(yǎng)基4h+2%PBS 處理24h)、模型組(無血清培養(yǎng)基4h +最佳濃度FIZZ1處理24h)、DAPT組(最佳濃度DAPT的無血清培養(yǎng)基4h +最佳濃度FIZZ1處理24h)。96孔板每組各5個復孔。將細胞消化后離心收集細胞團，用Trizol方法提取細胞總RNA。各樣本取相同質(zhì)量的RNA進行DNA逆轉(zhuǎn)錄,RT-PCR方法檢測a-SMA、NOTCH的表達。GAPDH基因作為檢測基因表達的內(nèi)參對照。反應(yīng)體系中的引物設(shè)計如下：NOTCH上游序列: 5＇-GGGTGGTCAGGAAAATCATGTCA-3＇，下游序列: 5＇-AGTTCACAGTGGGGACCAGTAT-3＇，擴增長度257bp；a-SMA上游序列: 5′-GACCCAGATTATGTTTGAGACC-3＇，下游序列: 5＇-TCCAGAGTCCAGCACAATACCA-3＇，擴增長度112bp；GAPDH上游序列：5＇-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3＇，下游序列：5＇-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3＇ ，擴增長度240bp。循環(huán)參數(shù):預變性95℃ 3min，變性95℃ 30s，退火60℃ 30s，延伸72℃ 60s，40個循環(huán)。

六、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、FIZZ1誘導HELF細胞向肌成纖維細胞增殖

用不同濃度FIZZ1刺激HELF后，與對照組相比，見細胞間隙減小，細胞核質(zhì)比縮小，形態(tài)由寬大梭形變成長梭形，細胞數(shù)量增多(圖1B)。CKK8實驗結(jié)果顯示1ug/mLFIZZ1組OD值最高，較空白組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(t=20.54,P=0.025(表1)，作為最佳實驗濃度。實時熒光定量PCR顯示模型組(1ug/mL FIZZ1)a-SMA表達較對照組顯著增高(t=23.42,P=0.031﹚(圖2)，以上結(jié)果均提示FIZZ1刺激能促進HELF向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化。

二、FIZZ1刺激HELF細胞轉(zhuǎn)化中激活NOTCH信號通路

RT-PCR實驗顯示，用1ug/mLFIZZ1刺激HELF細胞后，與對照組相比，NOTCH1的表達顯著增高(t=19.21,P=0.023﹚(圖2)，說明 FIZZ1 誘導HELF向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化過程中激活NOTCH信號通路。用不同濃度DAPT干預以阻斷NOTCH信號通路，與FIZZ1組相比，細胞增殖數(shù)量變少(圖1C)，OD值顯著降低(表2)，a-SMA表達明顯下降(圖2)，說明NOTCH信號通路抑制劑DAPT能抑制FIZZ1介導HELF細胞增殖。

圖1 FIZZ1及DAPT對HEFL增殖的影響(×200)

表1 不同濃度FIZZ1對肌成纖維細胞的增殖影響

表2 不同濃度DAPT對FIZZ1誘導HEFL增殖的影響

圖2 各組HELF細胞a-SMA、NOTCH mRNA的表達

討 論

肌成纖維細胞(MFb)被認為是纖維化疾病的“靶細胞”，在正常肺間質(zhì)中以非活化形式少量存在。大量MFb主要來源是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和原位成纖維細胞(Fb)的激活與轉(zhuǎn)化兩種方式。正常肺組織中存在大量原位Fb，在促纖維化因素作用下，F(xiàn)b被持續(xù)激活，大量增殖并產(chǎn)生纖維連接蛋白和膠原，與此同時，F(xiàn)b獲得MFb表型[5]，特征性表達a-SMA，參與組織損傷修復，逐漸形成纖維灶。a-SMA表達受到許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，也受表觀遺傳學調(diào)控[6]。

FIZZ1作為缺氧誘導的有絲分裂因子，在正常肺內(nèi)特異性表達,但量很少，其兼具炎癥因子和生長因子的特性，而在病理情況下，其具有刺激肺動脈平滑肌細胞增殖和血管收縮、促進肌成纖維細胞分化及激活產(chǎn)生細胞外基質(zhì)等功能[7]。本課題組前期研究已證實在間質(zhì)性肺纖維化動物模型的肺組織中FIZZ1有高表達[3,8]，提示FIZZ1參與肺間質(zhì)纖維化的形成過程。此次研究為了進一步探討FIZZ1介導的分子通道對靶細胞的作用機制，我們用不同濃度的FIZZ1刺激HELF細胞，發(fā)現(xiàn)細胞增殖率較對照組增高，在1.0ug/mL濃度時最為明顯，且細胞外形變大，核更大更圓，具有MFb的外形特點。另外，本研究中RT-PCR結(jié)果顯示,選用最佳濃度1.0ug/mL FIZZ1刺激后，作為MFb最主要的標志a-SMA mRNA水平明顯增高，以上均說明FIZZ1參與成纖維細胞(Fb)向肌成纖維細胞(MFb)的轉(zhuǎn)化過程。

FIZZ1作為新發(fā)現(xiàn)的炎癥介質(zhì)可能參與MFb的形成，但是通過何種信號通路發(fā)揮作用呢？NOTCH信號通路參與調(diào)節(jié)細胞的増殖、分化和凋亡等生命活動，影響著動物的生長和發(fā)育[9],與肺部疾病密切相關(guān)[10]。NOTCH信號通路異常激活可致使成纖維細胞異常增殖，并分化為MFb和細胞外基質(zhì)[11]。經(jīng)典NOTCH信號通路主要是通過相鄰細胞間的跨膜受體(NOTCH1-4)與膜系配體[Delta-like(Dll1,3-4)和Jagged(Jag)1-2]結(jié)合而啟動,NOTCH受體的胞外段被基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)切割，胞內(nèi)段(NICD)被γ-分泌酶裂解并釋放轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，與下游效應(yīng)蛋白CSL結(jié)合，激活NOTCH靶基因的轉(zhuǎn)錄[12]，調(diào)控細胞增殖、分化[13]。研究表明，NOTCH信號的激活主要取決于γ-分泌酶的活性，γ-分泌酶特異性抑制劑(DAPT)能夠阻斷NOTCH受體活化的中心環(huán)節(jié)，使NOTCH受體分子無法進一步轉(zhuǎn)變?yōu)橛行У幕钚云?，進而完全阻斷NOTCH信號通路的激活[14]。本研究結(jié)果，用FIZZ1刺激HELF細胞后NOTCH的mRNA較對照組增高，用DAPT提前處理后NOTCH的mRNA含量較模型組明顯降低，提示FIZZ1刺激HELF表型轉(zhuǎn)化過程中激活NOTCH信號通路,用DAPT阻斷NOTCH信號通路可以抑制細胞轉(zhuǎn)化及增殖。

綜合上述，F(xiàn)IZZ1可能通過NOTCH信號通路的激活促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化增殖，導致a-SMA分泌增多，加重肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。如果能尋找合適的靶點阻斷該通路，可能會減輕肺間質(zhì)纖維化的進程。