劉云鋒, 鄭 浩, 車 迪, 皮 蕾, 付蘭燕, 顧曉瓊
(1.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗(yàn)科,廣東 廣州 510623;2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心標(biāo)本庫(kù),廣東 廣州 510623)
川崎?。↘awasaki disease,KD)是一種以全身中、小動(dòng)脈炎癥性病變?yōu)橹饕卣鞯募毙园l(fā)熱性疾病,可累及冠狀動(dòng)脈引起冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張和動(dòng)脈瘤,流行病學(xué)研究結(jié)果顯示,近年來(lái)亞洲地區(qū)KD的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1-2]。KD主要的病理特征為血液高黏、高聚、高凝,血小板(platelet,PLT)大量聚集并引起血栓栓塞[3],是我國(guó)小兒后天性心臟病的主要原因之一。目前臨床上常以阿司匹林作為該病抗PLT聚集的藥物,但有研究結(jié)果顯示,部分患者會(huì)出現(xiàn)藥物抵抗、并發(fā)冠狀動(dòng)脈損傷及黏膜損傷或消化道出血等不良癥狀[4]。近年來(lái),黃連素(berberine,BB)作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥,其抗PLT聚集的功能引起了人們的重視。BB能降低二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、膠原和花生四烯酸誘導(dǎo)的PLT血栓素A2(thromboxane A2,TXA2)的釋放,能明顯地抑制PLT激活因子(platelet activating factor,PAF)途徑[5],從而抑制PLT聚集。除此之外,有臨床研究結(jié)果表明,BB能改善同樣具有血液高黏、高聚等血液流變學(xué)改變的2型糖尿病,降低其血漿黏度、減少紅細(xì)胞和PLT聚集[6]。然而,BB是否能改善KD患者PLT聚集情況,尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),觀察BB能否降低KD患兒PLT聚集率,為BB用于KD的抗栓治療提供理論依據(jù)。
選取2015年8月—2019年8月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心心血管科確診的71例KD患兒作為KD組,其中男45例、女26例,年齡(2.81±1.22)歲;另選取同期在兒童保健科就診的71名健康兒童作為對(duì)照組,其中男49例、女22例,年齡(2.48±1.31)歲。2組研究對(duì)象年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。KD患兒均采用2004年美國(guó)心臟協(xié)會(huì)制定的診斷指南[7]確診,所有患兒均排除腺病毒感染、EB病毒感染、藥物過(guò)敏綜合征、Stevens-Johnson綜合癥、猩紅熱等發(fā)熱性疾病。對(duì)照組兒童均排除既往KD病史、感染性疾病、心血管疾病、阿司匹林過(guò)敏癥、PLT減少癥等。
采集所有研究對(duì)象全血并用乙二胺四乙酸抗凝,110×g離心5 min,分離上層富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)。取500 μL PRP并加入等量0.9%氯化鈉溶液后混勻,110×g離心5 min,洗滌1次后棄去上清,加入500 μL 0.9%氯化鈉溶液重懸并調(diào)節(jié)PLT濃度為(100~300)×109/L。加入0.025 mol/L氯化鈣15 μL混勻,靜置30 min待測(cè)。運(yùn)行PLT聚集儀(美國(guó)Helena Laboratories公司),取靜置后的待測(cè)標(biāo)本分成2份,每份各200 μL。使用0.9%氯化鈉溶液對(duì)儀器進(jìn)行空白校準(zhǔn)。校準(zhǔn)完成后其中1份加入二甲基亞砜25 μL,另一份加入5 mg/mL BB 25 μL,37 ℃溫浴3 min后,迅速加入5 μmol/L ADP(美國(guó)Helena Laboratories公司)25 μL開(kāi)始測(cè)定,使用PLT聚集儀繪制PLT聚集曲線并獲得最大聚集率。
采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。呈偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(M)[四分位數(shù)(P25~P75)]表示,組間比較采用秩和檢驗(yàn)。樣本間計(jì)數(shù)資料比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析。年齡、性別等計(jì)量資料的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
對(duì)不同離心速度(90、110、130×g)和不同離心時(shí)間(5、8、10、15 min)進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,110×g離心5 min所得PRP的PLT濃度最高。見(jiàn)表1。
選擇10例健康體檢者標(biāo)本,分別加入二甲基亞砜及不同濃度BB(0、2.5、5.0、10.0 mg/mL)各25 μL后測(cè)定PLT最大聚集率。結(jié)果顯示,當(dāng)BB濃度為0、2.5、5.0、10.0 mg/mL時(shí),PLT最大聚集率分別為32.1(27.0~37.8)%、21.6(15.3~23.4)%、11.2(9.0~18.3)%、 10.7(8.1.0~17.4)%,因此選取5 mg/mL為BB最適實(shí)驗(yàn)濃度。
KD組和對(duì)照組的PLT最大聚集率均下降,2組樣本添加BB前、后PLT聚集率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。
表2 添加BB前、后PLT聚集率比較 %,±s
表2 添加BB前、后PLT聚集率比較 %,±s
注:與添加BB前PLT聚集率比較,*P<0.05
組別 例數(shù) 加BB前 加BB后 t值 P值對(duì)照組 71 26.25±3.32 10.32±2.11* 9.523 <0.05 KD組 71 18.32±2.51 6.23±1.59*10.987 <0.05
KD是一種以全身小動(dòng)脈炎為病理改變的疾病,多發(fā)于嬰幼兒及兒童,絕大多數(shù)患者經(jīng)過(guò)丙種球蛋白治療后可逐漸轉(zhuǎn)歸,預(yù)后良好。但15%~30%的患者可侵犯冠狀動(dòng)脈,嚴(yán)重者可并發(fā)冠狀動(dòng)脈瘤破裂、心肌梗死等,是兒童后天性心臟病的主要原因[7]。KD患者由于免疫功能異常,在炎性因子作用下,血管內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激,內(nèi)皮下的膠原組織暴露,誘導(dǎo)血液中的PLT及淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞黏附于暴露的膠原纖維上;同時(shí)PLT發(fā)生形態(tài)變化,貯存于致密顆粒內(nèi)的ADP及5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)被釋放,進(jìn)一步促使PLT聚集。由于血液長(zhǎng)期處于高凝高聚狀態(tài),容易形成血栓引起冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄和閉塞,甚至?xí)纬晒跔顒?dòng)脈瘤,危害兒童健康。
阿司匹林是目前最主要的治療K D的抗栓藥物,主要通過(guò)抑制P LT環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)乙酰化,阻止花生四烯酸(arachidonic acid,AA)轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎丨h(huán)內(nèi)過(guò)氧化物,阻斷TXA2生成[8],從而達(dá)到抗PLT聚集的目的。但阿司匹林治療存在個(gè)體差異,少數(shù)個(gè)體使用阿司匹林后低反應(yīng)或無(wú)反應(yīng),也有報(bào)道稱長(zhǎng)期大劑量服用阿司匹林,以及在服用阿司匹林藥物時(shí)感染水痘或流感病毒的患兒發(fā)生瑞氏綜合征的風(fēng)險(xiǎn)較其他兒童高[9]。由于阿司匹林抗栓治療存在局限性,所以臨床上需要有其他藥物協(xié)助阿司匹林一同改善KD患兒PLT聚集情況。
BB是從毛茛科黃連植物根狀莖中提取的一種植物生物堿,以前主要用于治療腸道炎癥伴發(fā)熱。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn),BB具有明顯的抗腫瘤及抗2型糖尿病的作用[6]。另有研究結(jié)果顯示,BB是一種具有抑制凝血酶誘導(dǎo)PLT活性的直接凝血酶抑制劑[10]。BB主要通過(guò)降低TXA2、提高環(huán)磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量來(lái)調(diào)節(jié)PLT聚集的第二信使Ca2+,使Ca2+從致密小管載出減少,抑制PLT釋放功能。cAMP含量增高能夠抑制磷酯酶A的活化,從而通過(guò)抑制PAF途徑[5],達(dá)到抗PLT聚集的目的。有研究結(jié)果表明,BB聯(lián)合其他常規(guī)藥物能更有效地抑制PLT聚集[11]。
本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),比較加入BB前、后KD組和對(duì)照組PRP PLT聚集率的變化,初步探討B(tài)B是否具有抗KD患兒PLT聚集的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用110×g離心5 min制備PRP,體外加入5 mg/mL BB溶液進(jìn)行預(yù)處理為最適反應(yīng)條件。本研究結(jié)果顯示,對(duì)照組和KD組PRP體外經(jīng)BB溶液處理后,PLT聚集率均比處理前有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而且經(jīng)BB處理后KD組PLT聚集率與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明BB在體外能有效發(fā)揮抗PLT聚集作用。本研究中KD組基礎(chǔ)PLT聚集率為(18.32±2.51)%,比正常組PLT聚集率[(26.25±3.32)%]低,這可能是由于本實(shí)驗(yàn)使用的KD患兒標(biāo)本均是在患兒確診并使用阿司匹林抗栓治療后收集的,導(dǎo)致KD組基礎(chǔ)PLT聚集率比對(duì)照組低。然而即便如此,加入BB后,對(duì)照組與KD組PLT聚集率仍明顯降低,由此推測(cè),BB和阿司匹林可能在抗栓治療上有協(xié)同作用。
由于本研究樣本量小,未能進(jìn)行深入研究,也未進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,希望今后進(jìn)一步驗(yàn)證BB在KD患兒抗栓治療中的作用,降低KD患兒血栓形成風(fēng)險(xiǎn)提供參考。