蒿葉霞， 顏新生， 楊薈薈， 胡元萍， 廖 鑫， 劉澤金

（武漢亞心總醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430056）

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）屬于β屬冠狀病毒，基因組為線性的單股正鏈RNA，為已知可感染人類(lèi)的第7種冠狀病毒[1]，其基因特征與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndromecoronavirus，SARS-CoV）和中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（middle east respiratory syndromecoronavirus，MERS-CoV）有明顯區(qū)別。我國(guó)將SARS-CoV-2核酸檢測(cè)作為新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的確診方法。本研究旨在通過(guò)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，監(jiān)測(cè)SARS-CoV-2核酸在患者體內(nèi)持續(xù)時(shí)間及載量變化趨勢(shì)，進(jìn)而分析病毒載量與COVID-19疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為更好地預(yù)防和控制疾病傳播提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2020年1月29日—2月22日武漢亞心總醫(yī)院COVID-19患者264例，包括SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性的確診患者158例，及首次SARSCoV-2核酸檢測(cè)陰性者104例或可疑者2例，但臨床癥狀和電子計(jì)算機(jī)斷層掃描結(jié)果符合《新型冠狀病毒肺炎診療指南（試行第五版）》[2]臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，后期經(jīng)核酸檢測(cè)確診為COVID-19的患者106例。根據(jù)診療指南將患者分為輕癥組（包括輕型和普通型）和重癥組（包括重型和危重型）。記錄2組患者CT值變化趨勢(shì)及入院后核酸的轉(zhuǎn)陰時(shí)間。以連續(xù)2次核酸檢測(cè)均為陰性的末次檢測(cè)時(shí)間作為患者核酸轉(zhuǎn)陰的時(shí)間。本研究經(jīng)武漢亞心總醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審核通過(guò)（WAGHMWC-KY-2020004），并批準(zhǔn)予以豁免患者知情同意。

1.2 試劑與儀器

核酸提取試劑為Magen磁珠法病毒總核酸提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）。自動(dòng)核酸提取儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，新型冠狀病毒ORF1ab/N基因雙重核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。Cobas Z480型熒光定量PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自瑞士羅氏公司。

1.3 樣本采集

采集所有研究對(duì)象鼻咽拭子，置于含病毒保存液的一次性病毒采樣管（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）內(nèi)，24 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.4 SARS-CoV-2核酸檢測(cè)

樣本采集后首先進(jìn)行56 ℃、30 min滅活處理。滅活后根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒核酸的提取。SARS-CoV-2核酸檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，針對(duì)SARS-CoV-2基因組中開(kāi)放閱讀框（open reading frame 1ab，ORF1ab）基因和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）基因進(jìn)行檢測(cè)。核酸檢測(cè)結(jié)果（Ct值）判讀以試劑說(shuō)明書(shū)建議為準(zhǔn)，對(duì)可疑結(jié)果通知臨床重新采樣復(fù)查。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果確定為陽(yáng)性，需滿(mǎn)足同1份樣本中SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因至少1個(gè)靶標(biāo)特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用MedCalc軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組患者的Ct值比較和核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間比較均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

264例COVID-19患者中，男142例，女122例，年齡（55.7±16.11）歲。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療指南（試行第五版）》[2]將患者分為輕癥組（包括輕型和普通型）和重癥組（包括重型和危重型）2組，其中輕癥組243例，重癥組21例。

2.2 2組患者病毒載量

重癥組患者病毒載量（Ct值為25.80±4.46）高于輕癥組患者（Ct值為30.25±4.26），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)表1。

2.3 2組患者轉(zhuǎn)陰時(shí)間

截至2020年3月7日，輕癥組患者仍有34人SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果未轉(zhuǎn)陰，重癥組患者仍有4例未轉(zhuǎn)陰，未列入統(tǒng)計(jì)范圍。重癥患者核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間（26.7±5.6）d較輕癥患者（16.3±4.7）d長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（表1）。根據(jù)21例重癥患者Ct值變化作圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)COVID-19患者發(fā)病早期病毒載量（Ct值）水平較高，隨著治療時(shí)間逐漸降低直至轉(zhuǎn)陰（圖1）。

表1 2組患者的病毒載量和病毒核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間比較±s

表1 2組患者的病毒載量和病毒核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間比較±s

組別 病毒載量 病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間/d輕癥組 30.25±4.26 16.3±4.7重癥組 25.80±4.46 26.7±5.6 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖1 COVID-19重癥患者Ct值在診療過(guò)程中的變化趨勢(shì)

3 討論

COVID-19疫情傳播迅速，對(duì)人民群眾生命安全和身體健康造成了嚴(yán)重的威脅。SARSCoV-2核酸檢測(cè)是確診COVID-19和患者痊愈出院的主要依據(jù)，SARS-CoV-2核酸在體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間和病毒載量變化情況是臨床治療和開(kāi)展防疫工作所關(guān)注的問(wèn)題。

本研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19重癥組患者體內(nèi)SARS-CoV-2病毒載量（Ct值為25.80±4.46）明顯高于輕癥組患者（Ct值為30.25±4.26）（P＜0.001），且SARS-CoV-2核酸在重癥組患者體內(nèi)存在時(shí)間[（26.7±5.6）d]明顯長(zhǎng)于輕癥組患者[（16.3±4.7）d]（P＜0.001），這在一定程度上說(shuō)明核酸病毒載量與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，早期重點(diǎn)關(guān)注并進(jìn)行有效的治療可以減少患者由輕型向重型轉(zhuǎn)變的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而降低患者病死率。

本研究還發(fā)現(xiàn)，多數(shù)COVID-19患者在疾病早期SARS-CoV-2病毒載量即達(dá)到高峰，隨著治療進(jìn)展和時(shí)間的推移，病毒載量逐漸降低，直至轉(zhuǎn)陰，與其他研究[3-4]報(bào)道的SARS-CoV-2的傳播可能發(fā)生在感染早期的結(jié)論一致。2003年非典型性肺炎疫情后有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV的傳播主要發(fā)生在發(fā)病后數(shù)天[5]，并與疾病早期呼吸道病毒載量有關(guān)，病毒載量在癥狀出現(xiàn)后約10 d達(dá)到峰值[6]。所以，COVID-19的防控策略可能需要更加嚴(yán)格，對(duì)于早期出現(xiàn)癥狀的患者要及時(shí)診斷和隔離。

本研究在病例分析過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，患者在治療過(guò)程中出現(xiàn)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陰性，隨后又轉(zhuǎn)為陽(yáng)性的情況，這可能與病毒感染的部位、樣本類(lèi)型以及樣本采集與存放方法、RNA提取方法和核酸檢測(cè)試劑盒性能等多方面因素有關(guān)[7]，導(dǎo)致核酸檢測(cè)結(jié)果與臨床癥狀、影像學(xué)檢查結(jié)果不相符。本研究患者痊愈出院標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)參考核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間和臨床表現(xiàn)。在COVID-19患者SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)陰，尚不能排除假陰性時(shí)，需重新采樣送檢，2次及以上（間隔24 h）核酸檢測(cè)均為陰性，方可確認(rèn)SARSCoV-2核酸轉(zhuǎn)陰。

本研究尚有不足之處，未能收集到所有患者首次核酸檢測(cè)陽(yáng)性的時(shí)間，尤其在早期存在確診后不能及時(shí)收治的情況下，首次診斷時(shí)間尤為重要，需要通過(guò)更加全面的流行病學(xué)調(diào)查進(jìn)一步深入研究。