錢巍， 樓國強(qiáng)， 周卓琳， 王嘉， 劉秀潔， 郝卯林， 王萬鐵△

姜黃素通過干預(yù)細(xì)胞自噬減輕大鼠缺血/再灌注肺損傷*

錢巍1， 樓國強(qiáng)2▲， 周卓琳2， 王嘉3， 劉秀潔2， 郝卯林2， 王萬鐵2△

（1杭州臨安區(qū)人民醫(yī)院全科醫(yī)療科，浙江 臨安 311300；2溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所，浙江 溫州 325035；3杭州醫(yī)學(xué)院圖書館，浙江 杭州 310052）

探討姜黃素（CUR）在大鼠缺血/再灌注（I/R）肺損傷中的作用及其與細(xì)胞自噬的關(guān)系。構(gòu)建大鼠I/R肺損傷模型，40只大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組（sham組）、I/R組、溶劑組（DMSO組）、CUR組和CUR+雷帕霉素（Rap）組（CUR-Rap組）；根據(jù)分組于大鼠術(shù)前分別腹腔注射生理鹽水、DMSO、CUR和CUR+Rap，造模結(jié)束后取肺組織測算濕/干重比（W/D）、總肺含水量（TLW）、肺泡損傷率（IAR），檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）水平，光鏡和電鏡分別觀察肺組織形態(tài)及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況以提示自噬水平。與sham組相比，其余各組肺組織的W/D、TLW、IAR和MDA含量均升高，SOD活性降低，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果提示自噬水平上升（<0.05），肺組織損傷加重且細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞加重。與DMSO組相比，CUR組肺組織的W/D、TLW、IAR和MDA含量均下降，SOD活性增強(qiáng)，自噬水平下降（<0.05），肺組織和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷較輕。與CUR組相比，CUR-Rap組肺的W/D、TLW、IAR和MDA含量均升高，SOD活性降低，自噬水平上升（<0.05），肺組織及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞更重，可見自噬小體。姜黃素可減輕大鼠肺I/R損傷，其機(jī)制可能與其減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。

自噬；肺缺血/再灌注損傷；姜黃素；氧化應(yīng)激

肺缺血/再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury， LIRI）是指肺組織在經(jīng)歷一段時間的缺血后，再恢復(fù)血流供應(yīng)時肺損傷進(jìn)一步加重的病理生理現(xiàn)象，嚴(yán)重可危及生命。LIRI是急性肺損傷（acute lung injury， ALI）的一種，繼發(fā)于肺栓塞再通、肺移植等［1-2］，由于其機(jī)制比較復(fù)雜，到目前為止尚未有特異性的診斷標(biāo)準(zhǔn)，因而也尚無有效的預(yù)防和治療手段。姜黃素（curcumin， CUR）是一種酸性多酚類物質(zhì)，有較為廣泛的藥理活性，在抗炎、抗腫瘤等方面都有重要作用［3-4］。近年來研究表明，姜黃素對LIRI也可能有一定的防治作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠LIRI模型中，當(dāng)使用劑量為200 mg/kg的姜黃素腹腔注射給藥時，其對肺損傷的防治效果最為明顯［5-7］，故本實(shí)驗(yàn)基于此劑量，進(jìn)一步探討姜黃素對LIRI的防治作用及相關(guān)機(jī)制（如細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激等），為臨床用藥提供更多的理論支持。

材料和方法

1　動物

清潔級SD大鼠，雄性，體重200~220 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號為SCXK（浙）2018-0149。

2　主要試劑

DMSO、雷帕霉素（rapamycin， Rap）和水合氯醛購于中國上海生工生物技術(shù)有限公司；姜黃素購于Sigma；丙二醛（malondialdehyde， MDA）試劑盒與超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）試劑盒均購自中國南京建成生物工程研究所； BCA蛋白定量試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗大鼠AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase， AMPK）/p-AMPK抗體、抗哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）/p-mTOR抗體、抗LC3-Ⅱ抗體、抗p62抗體、抗beclin 1抗體和抗GAPDH抗體均購自Abcam；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔Ⅱ抗由中國博蘊(yùn)提供。

3　主要方法

3.1大鼠LIRI模型的構(gòu)建手術(shù)前腹腔注射5%水合氯醛（10 mL/kg體重）麻醉大鼠后，切開大鼠頸部并進(jìn)行機(jī)械通氣，小動物呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為：潮氣量0.25 mL/kg，呼吸頻率80次/分，吸呼比3∶4，氧氣濃度100%。打開左側(cè)胸腔并暴露左肺門，動脈夾將肺門夾閉30 min，以肺不再隨機(jī)械通氣膨脹收縮為準(zhǔn)；之后松開動脈夾，進(jìn)行3 h的再灌注，監(jiān)測生命體征。3 h再灌注后，剪破心臟處死大鼠并留取肺組織。

3.2實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)將大鼠分為5組，每組8只，術(shù)前12 h禁食。各組分別作如下處理：（1）假手術(shù)組（sham組）：術(shù)前1 h腹腔注射生理鹽水；機(jī)械通氣后僅開胸但不夾閉肺門，3.5 h后處死大鼠取肺組織；（2）I/R組：術(shù)前1 h腹腔注射生理鹽水開胸夾閉肺門0.5 h，再灌注3 h后處死大鼠取組織；（3）溶劑組（DMSO組）：稱量體重后，術(shù)前1 h腹腔注射DMSO溶液，余操作同I/R組；（4）姜黃素組（CUR組）：術(shù)前1 h腹腔注射姜黃素200 mg/kg，即姜黃素溶液20 mL/kg，余操作同I/R組；（5）姜黃素+雷帕霉素組（CUR-Rap組）：氣管插管前1 h腹腔同時注射姜黃素溶液200 mg/kg及自噬激動劑雷帕霉素溶液1.5 mg/kg，余操作同I/R組。

3.3大鼠肺組織濕干重比和總肺含水量的檢測將大鼠處死并立即取左肺上葉組織，漂洗去除組織表面殘留血液并用濾紙吸干，稱重記為濕重（wet weight， W），將該組織于70℃下烘干24 h并再次稱重，記為干重（dry weight， D）。計算兩者之比，即為肺組織濕干重比（W/D），同時計算總肺含水量（total lung water， TLW）： TLW=（W-D）/D。上述兩者均可作為肺組織損傷情況指標(biāo)。

3.4氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測按照試劑盒說明書，取已測定濃度的肺組織勻漿液進(jìn)行超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量的檢測。

3.5組織形態(tài)學(xué)和肺泡損傷定量指標(biāo)的計算各組大鼠處死后，剪取左肺下葉組織塊，先進(jìn)行組織固定脫水，再通過透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟等步驟，最后用蘇木素-伊紅（HE）染色并封片，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺組織標(biāo)本的形態(tài)，主要包括肺泡腔出血情況、間質(zhì)水腫情況、中性粒細(xì)胞浸潤情況等。當(dāng)肺泡腔中有3個及以上的細(xì)胞或腔內(nèi)有液體滲出，則定義此為損傷肺泡，在200×鏡下隨機(jī)連續(xù)觀察10個視野，計數(shù)每個視野下的損傷肺泡個數(shù)，同時計數(shù)總肺泡的個數(shù)，用肺泡損傷率（injured alveoli rate，IAR）作為肺泡損傷定量指標(biāo)：IAR（%） =損傷肺泡個數(shù)/總計肺泡個數(shù)×100%。

3.6細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察用生理鹽水洗去肺組織表面血漬后，在冰上迅速用手術(shù)刀片切長寬高度各為1 mm的組織塊，然后分別經(jīng)過組織塊固定、塊染、丙酮梯度脫水、浸透、包埋聚合、半薄切片、超薄切片等步驟后，置于透射電鏡下觀察，拍取照片并保存。

3.7Western blot法檢測肺組織自噬相關(guān)蛋白的水平用含PMSF的RIPA裂解液將各組肺組織充分裂解，低溫高速離心后收集上層清液得到蛋白溶液，并對其進(jìn)行BCA蛋白定量檢測。各組測定濃度后上樣等量蛋白，通過SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉與雜交、化學(xué)發(fā)光成像等步驟得到的圖像用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，其中LC3-Ⅱ、beclin 1和p62蛋白條帶與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶的累積吸光度（）分別進(jìn)行比較，比值作為各蛋白的相對表達(dá)水平。將p-AMPK與AMPK蛋白條帶之比、p-mTOR與mTOR蛋白條帶之比作為反映AMPK和mTOR蛋白磷酸化表達(dá)水平的相對指標(biāo)。

4　統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 21.0軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組樣本間均數(shù)的差異用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較，方差齊者兩兩比較用SNK-法，不齊者用Tamhane's T2法，以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　各組大鼠肺組織W/D和TLW的變化

與sham組相比，其余各組的W/D和TLW均有顯著升高（<0.05）；與I/R組和DMSO組相比，CUR組肺W/D和TLW下降（<0.05）；與CUR相比，CUR-Rap組肺W/D和TLW均明顯升高（<0.05），見表1。

2　各組大鼠肺組織SOD活力和MDA含量的變化

除sham組外，其余4組的肺組織均出現(xiàn)SOD活性下降，MDA含量明顯升高（<0.05），提示其余各組氧化應(yīng)激反應(yīng)加??；與DMSO組相比，CUR組的組織SOD活性上升，同時MDA含量下降（<0.05），而DMSO組SOD活性較I/R組無明顯變化（>0.05）；此外， CUR-Rap組較CUR組肺組織的SOD活性下降，而MDA含量升高（<0.05），見表1。

表1　各組肺組織濕/干重比、總肺含水量、SOD活性和MDA含量變化的比較

*<0.05sham group;△<0.05I/R group;▲<0.05DMSO group;#<0.05CUR group.

3　肺組織光鏡觀察結(jié)果及肺泡損傷定量

光鏡下可見，sham組的肺組織形態(tài)正常，間質(zhì)及肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，間質(zhì)無水腫，無炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡內(nèi)未見明顯滲液或紅細(xì)胞；其余各組肺組織形態(tài)均有異常，肺間質(zhì)有不同程度水腫，有肺泡變形塌陷，肺泡腔內(nèi)可見散在分布的紅細(xì)胞，尤其以I/R組和DMSO組為盛；與DMSO組相比， CUR組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂有所減輕，水腫及滲出、紅細(xì)胞漏出明顯減少；與CUR組相比， CUR-Rap組的肺間質(zhì)水腫更加嚴(yán)重、充血且有細(xì)胞滲出，肺泡壁也可見更多炎性細(xì)胞浸潤。肺泡損傷定量結(jié)果顯示，與sham組相比，其余各組的肺IAR均有升高（<0.05）；與I/R組和DMSO組相比， CUR組肺IAR降低（<0.05），而I/R和DMSO組IAR變化的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（>0.05）；與CUR相比， CUR-Rap組肺IAR明顯升高（<0.05），見圖1。

Figure 1.　HE staining of lung tissue and IAR in each group (×200). Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs sham group; △P<0.05 vs I/R group; ▲P<0.05 vs DMSO group; #P<0.05 vs CUR group

4　各組大鼠肺組織的透射電鏡觀察

透射電鏡下可見，sham組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見異常，線粒體結(jié)構(gòu)完整，嵴線清晰，板層小體內(nèi)容物豐富且結(jié)構(gòu)正常；其余各組的細(xì)胞微結(jié)構(gòu)則出現(xiàn)了不同程度的破壞。其中I/R、DMSO和CUR-Rap組的線粒體發(fā)生高度水腫，嵴線溶解甚至消失，板層小體內(nèi)容物減少，可見自噬體的形成；而CUR組的細(xì)胞損傷則有所減輕，線粒體輕微腫脹，結(jié)構(gòu)相對較為完整，板層小體內(nèi)容物較為完整，無明顯細(xì)胞自噬小體，見圖2。

Figure 2.　The ultrastructure of the lungtissue in each group observed under electron microscope (×15 000). Yellow arrow: mitochondria; blue arrow: lamellar bodies; red arrow: autophagic bodies. The scale scale=0.5 μm.

5　各組大鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白水平的變化

通過Western blot檢測了自噬相關(guān)蛋白的水平，結(jié)果顯示，與sham組相比，其余各組肺組織AMPK蛋白磷酸化水平、beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白水平上升，mTOR蛋白磷酸化水平和p62蛋白水平下降（<0.05）；與DMSO組相比，CUR組的AMPK蛋白磷酸化水平下降，mTOR蛋白磷酸化水平和p62蛋白水平有明顯上升（<0.05）；與CUR組相比，CUR-Rap組的AMPK蛋白磷酸化水平、beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白水平則上調(diào)，mTOR蛋白磷酸化水平和p62蛋白表達(dá)下降（<0.05），見圖3。

Figure 3.　The protein levels of LC3-Ⅱ, beclin 1, p-AMPK, p-mTOR and p62 in the lung tissues of each group. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs sham group; △P<0.05 vs I/R group; ▲P<0.05 vs DMSO group; #P<0.05 vs CUR group.

討論

姜黃素提取自姜黃根莖，原本作為食品添加劑使用，但后被發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的生物活性。研究表明，姜黃素除了在抗炎抗腫瘤等方面有效，其在多種肺部疾病中也發(fā)揮有重要作用［8］，例如在急性肺損傷時，姜黃素可以抑制 NF-κB的活化［9］，抑制c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）［7］表達(dá)，從而減少肺組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)；也可以通過抑制caspase-12等方式抑制細(xì)胞凋亡［6，10］，從而減輕小鼠的再灌注肺損傷。此外，姜黃素還可減弱纖溶酶原激活物抑制劑1 （plasminogen activator inhibitor-1， PAI-1）的活性，減少細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）等促炎因子和趨化因子的表達(dá)，進(jìn)而減輕白細(xì)胞過度激活。

本實(shí)驗(yàn)在應(yīng)用姜黃素后檢測了肺組織損傷的相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，與DMSO溶劑組相比，應(yīng)用姜黃素后，大鼠缺血/再灌注引起的肺組織損傷顯著減輕，具體表現(xiàn)為W/D和TLW下降，光鏡下肺組織損傷有所減輕且IAR下降明顯；電鏡下也可見應(yīng)用姜黃素后，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的破壞明顯減輕。這表明，姜黃素對大鼠LIRI具有一定的防治作用。

以往研究證實(shí)，姜黃素可在某些腫瘤中對PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路起抑制作用［11］。本實(shí)驗(yàn)中，在將姜黃素與mTOR的特異性抑制劑-雷帕霉素合用后，姜黃素對LIRI的防治作用顯著減弱，提示姜黃素減輕大鼠LIRI可能與抑制mTOR信號通路有關(guān)。mTOR除了能影響凋亡、氧化應(yīng)激外，還作為自噬通路上游核心蛋白之一［12-13］，參與自噬程序的激活和自噬小體的形成。已有研究報道，在大鼠腦缺血再灌注損傷通路中，姜黃素可通過調(diào)控mTOR減輕再灌注損傷引起的細(xì)胞自噬［14］。

本實(shí)驗(yàn)通過將雷帕霉素與姜黃素合用，抑制姜黃素對mTOR的作用效應(yīng)，使mTOR磷酸化程度降低，進(jìn)而減輕其對自噬的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明，CUR-Rap組的beclin 1和LC3-Ⅱ等自噬正性蛋白表達(dá)明顯回升，同時組織和細(xì)胞損傷則加重，說明雷帕霉素可抑制姜黃素對LIRI的防治作用，并增強(qiáng)自噬水平，同時也提示了姜黃素可能是通過下調(diào)細(xì)胞自噬水平減輕大鼠LIRI的。p62可在自噬時降解，故能反映自噬的強(qiáng)弱。當(dāng)LC3 Ⅱ升高，p62同時降低，則表明自噬流通暢［15］。

此外，有研究表明，姜黃素預(yù)處理會影響LIRI大鼠的炎性細(xì)胞因子表達(dá)［16］。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，應(yīng)用姜黃素后，SOD活性增強(qiáng)且MDA含量下降，說明肺組織的氧化應(yīng)激水平下降，即姜黃素對大鼠LIRI的防治機(jī)制也可能與其提高細(xì)胞抗氧化能力，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)；而加用雷帕霉素后，相關(guān)肺組織的抗氧化能力降低，氧化應(yīng)激水平升高，這可能提示氧化應(yīng)激與細(xì)胞自噬也存在一定的相關(guān)性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建大鼠LIRI模型，證實(shí)了應(yīng)用姜黃素可減輕大鼠肺缺血/再灌注損傷，其機(jī)制主要與減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。

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Curcumin attenuates rat lung ischemia/reperfusion injury by interfering with autophagy

QIAN Wei1， LOU Guo-qiang2， ZHOU Zhuo-lin2， WANG Jia3， LIU Xiu-jie2， HAO Mao-lin2， WANG Wan-tie2

（1，，311300，；2，，325035，；3，310052，）

To investigate the role of curcumin （CUR） in lung ischemia/reperfusion （I/R） injury （LIRI） and its relationship with autophagy.40 SD rats were randomly divided into sham operation （sham） group， I/R group， solvent （DMSO） group， CUR group and CUR+rapamycin （CUR-Rap） group. The rats were intraperitoneally injected with normal saline， DMSO， CUR or CUR+Rap before operation. After the rat LIRI model was established， the lung tissues were taken to measure W/D， TLW， IAR， and the contents of SOD and MDA were also measured to indicate the oxidative stress level. Light and electron microscopes were used to observed the morphology and ultrastrucure of lung tissues. The expression levels of autophagy-related proteins were determined by Western blot to evaluate autophagy levels.Compared with sham group， wet weight/dry weight （W/D）， total lung water （TLW）， injured alveoli rate（IAR） and malondialdehyde （MDA） content in all other groups were increased， superoxide dismutase （SOD） activity was decreased， the levels of autophagy were increased （<0.05）， and lung tissue injury and cell ultrastructural damage were aggravated in CUR group. Compared with DMSO group， W/D， TLW and IAR and MDA content were decreased， SOD activity was decreased， autophagy levels were also decreased （<0.05）， and lung tissue and cell ultrastructural damage were attenuated. Compared with CUR group， W/D， TLW， IAR and MDA content were increased， SOD activity declined， the autophagy levels were increased （<0.05）， and damage of lung tissues and cells were more serious in CUR-Rap group.Curcumin attenuates the lung I/R injury in rats， and its mechanism may be related to the reduction of oxidative stress and the inhibition of autophagy.

Autophagy； Lung ischemia/reperfusion injury； Curcumin； Oxidative stress

R563； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.019

1000-4718（2020）11-2056-06

2020-03-25

2020-06-19

杭州市2018年社會發(fā)展科研入庫立項補(bǔ)助項目（No.201811）；溫州市基礎(chǔ)性科研項目（No.Y20180093）

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▲共同第一作者:并列第1作者

（責(zé)任編輯：宋延君，余小慧）