宋畢清，李海志

常州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇常州213000

根據(jù)中國(guó)藥典記載蜂房具有去腐、生肌、消炎、止痛、促進(jìn)創(chuàng)口早期愈合的作用[1]。目前已知蜂房含有酚酸類(lèi)、二苯基庚烷類(lèi)、萜類(lèi)、含氮類(lèi)、黃酮類(lèi)及酯類(lèi)等化學(xué)物質(zhì)，其藥理作用有抗腫瘤、抗菌、免疫抑制等[2]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)[3-4]認(rèn)為蜂房所含蛋白具有對(duì)抗腫瘤作用。如實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蜂房蛋白NVP可能通過(guò)激活ERK信號(hào)通路從而抑制HepG2細(xì)胞增殖。動(dòng)物在體研究[5]發(fā)現(xiàn)蜂房蛋白NVP能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。此外，蜂房對(duì)有機(jī)溶劑提取物也表現(xiàn)出顯著抗腫瘤作用[6-7]。劉勝等[8]研究發(fā)現(xiàn)其含蜂房的乳癌術(shù)后方有明顯降低乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用。研究表明[9]雌激素增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而乳癌術(shù)后方中蜂房是否具有雌激素目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)高效液相色譜法（HPLC法）檢測(cè)蜂房和乳癌術(shù)后方中雌二醇、炔雌醇、雌酮和己烯雌酚這4種雌激素的有無(wú)來(lái)判斷其是否適用于乳腺癌患者，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

LC-10AD型高效液相色譜儀、98-1-B電子調(diào)溫電熱套、SARTORIUS分析天平、KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器、RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、循環(huán)水式多用真空泵、十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(島津ODS 250 mm×4.6 mm,內(nèi)徑5μm)、雌二醇（100182-201205）、雌酮（100849-200501）、己烯雌酚（100033-201308）、炔雌醇（100052-200609）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用）；甲醇、氯仿、乙腈（色譜純）；娃哈哈純凈水。蜂房及乳癌術(shù)后方供試品：生黃芪30 g、黨參12 g、白術(shù)9 g、茯苓12 g、南沙參15 g、枸杞子15 g、仙靈脾15 g、巴戟天12 g、肉蓯蓉12 g、莪術(shù)30 g、蜂房12 g、石見(jiàn)穿30 g

1.2 樣品處理

1.2.1 雌激素對(duì)照品 精密稱(chēng)取雌二醇、炔雌醇、雌酮和己烯雌酚對(duì)照品各5 mg分置50 mL容量瓶中,加甲醇適量,40 kHz超聲處理15 min,放冷至室溫,加甲醇至刻度,搖勻,作為單組分對(duì)照溶液。精密稱(chēng)取對(duì)照品各3 mg置于同一50 mL量瓶中,加甲醇適量,40 kHz超聲處理15 min,放冷至室溫,加甲醇至刻度,搖勻制得混合對(duì)照溶液。

1.2.2 蜂房供試品 蜂房單味藥材粉碎，取0.5 g粗粉，以定性濾紙包裹，置于索氏提取器中，加入150 mL氯仿，回流提取5 h，提取液倒出，置于蒸發(fā)皿中揮干，用甲醇復(fù)溶，定容至10 mL，搖勻，取適量過(guò)0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液制樣，即得蜂房單味藥材供試品。

1.2.3 乳癌術(shù)后方供試品 乳癌術(shù)后方稱(chēng)重，8倍水煎煮2次，過(guò)濾，合并濾液，濾液定容，濃縮至(生藥)0.5 g/mL,取濃縮液1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋?zhuān)ㄈ荩瑩u勻后取適量過(guò)0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，制樣即得全方供試品。

1.3 HPLC法測(cè)定雌激素

色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(島津ODS 250 mm×4.6 mm，內(nèi)徑5μm);流動(dòng)相:乙腈-水(50：50);檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL;理論板數(shù)按雌二醇計(jì)算,不低于2 000[10]。按上述色譜條件依法檢測(cè)雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚4種雌激素。重復(fù)3次。取清晰穩(wěn)定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照品

根據(jù)混標(biāo)對(duì)照品色譜圖出峰時(shí)間分別為8.828、10.913、12.140、14.196 min，見(jiàn)圖1。和雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚4種雌激素的單品對(duì)照品色譜圖（見(jiàn)圖2～5），記錄對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間分別為8.824、10.892、12.159、14.112 min?？梢?jiàn)均有色譜峰與混標(biāo)色譜圖上的相對(duì)應(yīng)，見(jiàn)表1。

圖1 混標(biāo)Figure 1 Mixed Standard

圖2 雌二醇Figure 2 Estradiol

圖3 炔雌醇Figure 3 Ethinyl estradiol

圖4 雌酮Figure 4 Estrone

Figure 5己烯雌酚Figure5 Diethylstilbestrol

表1 對(duì)照品的出峰時(shí)間(min)Table 1 Peak time of reference substance(min)

2.2 樣品

2.2.1 蜂房單味藥材 索氏提取法提取后制樣，其色譜圖見(jiàn)圖6 ?？梢?jiàn)色譜圖中沒(méi)有與對(duì)照品單品及混標(biāo)4種雌激素對(duì)應(yīng)的峰。

2.2.2 乳癌術(shù)后方水提樣品 乳癌術(shù)后方水提樣品色譜峰出峰時(shí)間分別為4.560、5.525、8.644 min，見(jiàn)圖7。與對(duì)照品中4種雌激素?zé)o重疊峰。

圖6 蜂房Figure 6 honeycomb

圖7 乳癌術(shù)后方Figure 7 Recipe for breast cancer surgery

3 討論

中藥在我國(guó)乳腺癌術(shù)后的應(yīng)用普遍。一項(xiàng)5 046名患者參與的上海乳腺癌生存研究顯示97.2%的患者服用過(guò)膳食補(bǔ)充劑或中草藥，76.8%的乳癌患者曾使用過(guò)中藥，幾乎所有的中藥使用者都將中藥作為癌癥治療的一部分，3/4的人報(bào)告[11]說(shuō)中藥用于增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，約2/3的女性認(rèn)為有效。迄今，無(wú)論是觀察性研究還是臨床試驗(yàn)都未能證實(shí)保健品能夠改善癌癥患者的預(yù)后，相反還可能增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[12]。因此對(duì)膳食補(bǔ)充劑及中草藥的使用安全性檢測(cè)變得尤為重要。蜂膠、蜂王漿及蜂花粉等膳食補(bǔ)充劑具有雌激素樣作用[13]。有試驗(yàn)顯示0.8～4μg/mL蜂膠乙醇提取物和乙醚提取物明顯增強(qiáng)雌激素依賴(lài)的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增值。并通過(guò)17β-雌二醇不同濃度的提取物與人雌激素受體結(jié)合的試驗(yàn)、酵母基雄激素及孕酮受體轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)、未成熟雌性SD大鼠注射提取物試驗(yàn)闡明機(jī)理。結(jié)果提示蜂膠通過(guò)激活雌激素受體產(chǎn)生雌激素樣作用[14]。而雌激素增加乳癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，故臨床上禁用于乳癌術(shù)后患者，尤其是激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者。

該研究目的在于定性測(cè)定蜂房中是否含有雌激素，而非定量檢測(cè)，故色譜峰出現(xiàn)即定義為有，而與峰面積無(wú)關(guān)。單品和混標(biāo)的藥品劑量不同，所配制液體濃度稍有差異，峰面積有高低并不影響定性結(jié)論。通過(guò)比較圖2～5與圖1色譜出峰時(shí)間得出混標(biāo)色譜圖中依次出現(xiàn)的色譜峰對(duì)應(yīng)的雌激素為雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚，也說(shuō)明混標(biāo)并不影響各激素的色譜峰保留時(shí)間。蜂房單藥水提樣品和含蜂房的乳癌術(shù)后方在上述4種激素出現(xiàn)的保留時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)任何峰，說(shuō)明其不含這4類(lèi)雌激素，也說(shuō)明在乳癌術(shù)后方煎制過(guò)程中多藥相互作用后也沒(méi)有這4種雌激素的產(chǎn)生。而在其他時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)的峰與這4類(lèi)雌激素?zé)o關(guān)，可能與蜂房及乳癌術(shù)后方所含的其他物質(zhì)有關(guān)。所含物質(zhì)有待進(jìn)一步提取分析。

綜上所述，該次研究未發(fā)現(xiàn)蜂房及前述乳癌術(shù)后方含有雌二醇、炔雌醇、雌酮和己烯雌酚這4類(lèi)雌激素?；颊呖梢允褂梅浞考霸摲絼?。蜂房及乳癌術(shù)后方的化學(xué)成分和藥理活性還有待深入研究，今后有必要從化學(xué)單體分離、藥理活性及作用機(jī)制、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方面展開(kāi)系統(tǒng)研究，為蜂房及乳癌術(shù)后方等臨床應(yīng)用提供依據(jù)。