楊德泉，佘永紅

湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗所，湖南 吉首 416000

紅黑二丸，又名紅白二丸、巖丸子、鴛鴦七、山海棠，是一味土家族常用藥材，土家語稱捏龍免姐［1］。土家醫(yī)藥理論認為，紅黑二丸性微冷，味酸、辣。具有趕火止瀉，活血療傷，止血等功效。土家醫(yī)臨床用于熱瀉癥、心口痛、跌打傷痛、血熱出血、痢疾、淋濁、白濁、毒蛇咬傷等病癥［2,3］。紅黑二丸中含有β-谷甾醇、豆甾醇、表兒茶酸、表兒茶醛、表兒茶素、兒茶素等成分［4-6］。紅黑二丸雖常用于土家族醫(yī)臨床，但尚無質(zhì)量標準。為控制紅黑二丸藥材質(zhì)量，筆者通過民間用藥調(diào)查，參考有關(guān)文獻［7-10］，對其性狀、顯微結(jié)構(gòu)進行鑒別研究，建立了以β-谷甾醇為成分指標的TLC鑒別方法及HPLC含量測定方法，為建立紅黑二丸藥材的質(zhì)量標準提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀［包括VWD檢測器，Rev.B.03（16）化學色譜工作站］；AUW 220D電子天平；RMZ126RT型石蠟切片機［型號：RM2126RT，徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司］；OLYMPUS BX61電動顯微鏡；超聲波清洗器（型號：KQ5200型，昆山市超聲儀器有限公司）；SONY數(shù)碼單反相機（型號：DSLR-A450，索尼公司）。

1.2 試藥

β-谷甾醇（批號110851-201608，供含量測定用，含量以97.0%計）購自中國食品藥品檢定研究院。硅膠G薄層板購于德國化工技術(shù)（上海）有限公司和青島海洋化工廠分廠。乙腈、異丙醇為色譜純，水為純凈水，其余均為分析純。紅黑二丸藥材經(jīng)楊德泉主任藥師鑒定為中華秋海棠Begonia grandisDry.subsp.Sinensis（A.DC.）Irmsch.。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材性狀鑒別

塊莖呈扁圓球形或不規(guī)則塊狀，直徑0.7～3.0 cm。表面棕紅色至黑褐色，有不規(guī)則的皺紋。上端凹凸窩狀，偶有葉柄殘留須根。質(zhì)堅實，不易折斷，斷面類白色或淡紅棕色，粉性，散在微小的亮星。氣微、味微苦。見圖1。

2.2 顯微鑒別

2.2.1 根莖橫切片木栓細胞4～6列，切向延長、表面觀長方形或多角形。木栓細胞外側(cè)有時可見表皮細胞，表皮細胞外側(cè)附有角質(zhì)層，表皮細胞內(nèi)側(cè)常有受到擠壓的薄壁細胞。木栓層內(nèi)為薄壁細胞區(qū)，其內(nèi)散生維管束，維管束中導管束明顯，可見形成層和韌皮部，但形成層大多不明顯。皮層、中柱和髓部無明顯分界。薄壁細胞中含淀粉粒，有的含有簇晶或集合成簇狀的細小針晶群。顯微結(jié)構(gòu)見圖2。

2.2.2 粉末特征粉末淺黃棕色。淀粉粒眾多，單粒，圓形、橢圓形，層紋明顯，臍點點狀，直徑15～30 nm。草酸鈣針晶細小而多，呈簇狀存在，簇狀團塊直徑20～30 nm，可見簇晶。導管為環(huán)螺紋，直徑25～35 nm。木栓化細胞多角形，壁略平直。殘存的表皮細胞上偶見單細胞腺毛，內(nèi)含紅棕色分泌物，直徑15～25 nm。顯微特征見圖3。

2.3 薄層色譜鑒別

取紅黑二丸粉未（過4號篩）0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加甲醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得供試品溶液；另稱取β-谷甾醇10 mg置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)已烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20∶5∶8∶0.1）為展開劑，展開，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃烘至斑點顯色清晰。樣品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。結(jié)果見圖4 。

2.4 HPLC含量測定

2.4.1 色譜條件色譜柱：Agilent 5 TC C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-異丙醇（70∶30）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃，進樣量：20 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備精密稱取β-谷甾醇20.40 mg,置20 mL容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，作為β-谷甾醇的標準儲備溶液，濃度為0.989 mg/mL。精密吸取標準儲備溶液3 mL置于50 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，制成每1 mL含59.34 μg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備取本品粉末（過3號篩）約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加乙醇25 mL，超聲處理40 min，放冷，過濾，濾液揮干，加乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。同步稱取樣品粉末，測定水分，按干燥品計算含量。

2.4.4 陰性樣品溶液的制備取乙醇25 mL，置50 mL錐形瓶中，同供試品溶液制備方法操作，即得。

2.4.5 系統(tǒng)適用性試驗按“2.4.1”色譜條件測定，樣品中β-谷甾醇與其他組分的色譜峰分離度大于1.5，與對照品對應(yīng)的色譜峰的理論板數(shù)不低于16 000。供試品色譜中，在與對照品色譜峰相應(yīng)位置上檢出色譜峰。對照品、樣品及陰性樣品色譜圖見圖5。

2.4.6 線性關(guān)系考察精密吸取β-谷甾醇的標準儲備溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，混勻，得197.8 μg/mL的溶液，再分別精密吸取0.5、1、2、3、5、10 mL，置10 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，配制成9.89、19.78、39.56、59.34、98.9、197.8 μg/mL的系列對照品溶液。

分別精密吸取上述系列對照品溶液20 μL，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸處理，得β-谷甾醇的回歸方程：Y=335.73X+3.401 5，r=0.999 9。結(jié)果表明：β-谷甾醇進樣量在0.197 8～3.956 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.7 精密度實驗取同一濃度對照品溶液，連續(xù)進樣6次，β-谷甾醇峰面積的RSD為0.65%。

2.4.8 重復(fù)性實驗取采于吉首市寨陽村樣品6份，分別按樣品測定法測定。測定含量分別為0.271 1、0.268 2、0.275 2、0.266 9、0.266 0、0.267 8 mg/g，平均含量為0.269 2 mg/g，RSD為1.2%。

2.4.9 穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，于0、1、4、6、12 h，進樣測定峰面積，結(jié)果RSD為1.2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.10 加樣回收率試驗取采于吉首市寨陽村的樣品（含量為0.269 2 mg/g）6份，置50 mL錐形瓶中,分別吸取濃度為0.059 34 mg/mL的β-谷甾醇標準儲備溶液1.1 mL，按供試品溶液的方法制備。照“2.4.1”項下色譜條件測定，平均回收率為97.3%，RSD為2.9%。結(jié)果見表1。

2.5 樣品含量測定

精密稱取不同批次的紅黑二丸藥材粉末（過3號篩）0.5 g，按“2.4.3”項下下方法制備供試品溶液，并按“2.4.1”項下色譜條件進行分析，測定峰面積，用外標法計算出β-谷甾醇的含量，11批樣品含量測定結(jié)果見表2。

表1 回收率試驗結(jié)果

表2 紅黑二丸中β-谷甾醇含量

3 討論

民族藥質(zhì)量標準的研究建立，是合理、安全、有效應(yīng)用民族藥的保證，對民族藥走向現(xiàn)代化有極其重要的意義。本文通過對紅黑二丸藥材的性狀、顯微、薄層色譜、含量測定的研究，為建立紅黑二丸藥材標準提供科學依據(jù)。β-谷甾醇具有保護胃黏膜［11］、促凝血、活血化瘀、抗炎鎮(zhèn)痛、止瀉等［12］藥理活性，與土家醫(yī)臨床應(yīng)用紅黑二丸治療熱瀉癥、心口痛、跌打傷痛、血熱出血、痢疾等病癥相符合。選擇β-谷甾醇作為紅黑二丸藥材標準的指標性成分，使該藥質(zhì)量評價模式和標準關(guān)聯(lián)，為民族藥臨床應(yīng)用提供了科學理論支撐。