顧麗莎， 賈正燕， 張嘯， 王昌梅,3， 吳凱,3， 張無敵,3， 尹芳,3

(1.云南師范大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南康藝三七種植有限公司，云南 昆明 650032；3.吉林東晟生物質(zhì)能工程研究院，吉林 通化 134118)

1 引言

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)為五加科植物，又名田七、人參三七、參三七及金不換等[1]，主要分布在廣東、廣西、云南和四川等地[2]，喜溫暖而陰濕的環(huán)境.三七植株主要由根莖葉組成，傳統(tǒng)以根入藥[3]，是我國特有的中藥材，但三七根腐病嚴(yán)重影響了三七的產(chǎn)量和質(zhì)量.研究顯示，尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)等是引起三七根腐病的主要病原菌[4-7].

香樟樹(Cinnamomumcamphora(L.)Presl)是樟科( Lauraceae )樟屬(Cinnamomum)常綠大喬木，為亞熱帶常綠闊葉樹種，又名樟樹、烏樟、樟木、油樟及芳樟.我國樟樹資源豐富，主要生長于海南、四川、重慶、云南、福建、貴州和浙江等省區(qū)[8].吳傳茂等人[9]研究了樟樹葉乙醇提取物的抑菌作用，胡生輝等人[10]研究了樟樹葉水提物對木材腐朽菌的抑制作用，馬英姿等人[11]用杯碟法研究了樟樹葉精油對4種供試菌的抑制作用，這些研究均表明香樟樹葉提取物具有抑菌作用.

在三七根腐病菌的抑制方面，馬玉楠等人[12]研究了黃花蒿和丁香揮發(fā)油對三七病害的抑制作用，趙雅萌等人[13]研究了黃花蒿葉水提物對尖孢鐮刀菌的抑制作用，劉海嬌等人[14]研究了油菜揮發(fā)油對三七根腐病菌的抑制作用，劉繼紅等人[15]研究了沼液對三七根腐病菌的抑制作用;鑒于目前還沒有學(xué)者研究香樟樹葉提取物對三七根腐病的抑制作用，本實(shí)驗(yàn)將研究香樟樹葉水提物對三七根腐病菌中的尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的抑制效果.

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 香樟樹葉

實(shí)驗(yàn)用香樟樹葉為云南師范大學(xué)校園內(nèi)剛修剪下來的香樟樹葉.

2.1.2 三七根腐病菌

由云南省農(nóng)村能源工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的三七根腐病菌中的尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌.

2.1.3 儀器

SHZ-D循環(huán)水式真空泵、GMSX-280手提式高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、移液器、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、鼓風(fēng)干燥箱、水浴鍋、電磁爐、超凈工作臺、紗布、燒杯、培養(yǎng)皿、量筒、冷凝管、磨口牛角管、磨口接液瓶、打孔器、接種環(huán)、鑷子、玻璃棒和分液漏斗等.

2.1.4 主要試劑

PDA培養(yǎng)基、葡萄糖和瓊脂條.

2.1.5 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基[16]制作方法：將去皮后的馬鈴薯200 g切成小塊，加入1 000 mL水，小火煮30 min，過濾，在濾液中依次加入葡萄糖20 g、瓊脂條10 g并120 ℃加熱攪拌，溶解后加水至1 000 mL，趁熱分裝，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后倒入培養(yǎng)皿中.

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 三七根腐病菌的培養(yǎng)

在提前準(zhǔn)備好的PDA培養(yǎng)基上接種三七根腐病菌中的尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌，放到溫度為30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4-6 d，直到整個(gè)培養(yǎng)基中長滿菌落.

2.2.2 香樟樹葉的處理方法

將新鮮香樟樹葉剪碎后做以下處理：

(1)香樟樹葉水提物的制備

使用電子天平準(zhǔn)確稱取等量剪碎的香樟樹葉，分別在室溫和80 ℃提取，具體方法如下：

①室溫提取：取剪碎的香樟樹葉，加入10倍質(zhì)量的蒸餾水，室溫下浸泡48 h，用紗布過濾，取濾液，標(biāo)記備用.

②80 ℃提?。喝〖羲橄阏翗淙~，加入10倍質(zhì)量蒸餾水，置于1 L的圓底燒瓶中，80 ℃水浴4 h，用紗布過濾，取濾液，標(biāo)記備用.

(2)香樟樹葉揮發(fā)油的制備

將剪碎的香樟樹葉和10倍質(zhì)量的蒸餾水置于1 L的圓底燒瓶中，使用減壓蒸餾裝置蒸餾，收集蒸餾出液，倒入分液漏斗中，靜置分層，分離出油層，得淺黃色油狀液體.

2.2.3 抑菌試驗(yàn)方法

用移液器量取500 μL香樟樹葉水提物，加到提前準(zhǔn)備好的PDA培養(yǎng)基表面，用三角不銹鋼棒在培養(yǎng)基表面涂布均勻，再用滅菌的打孔器(Φ=9 mm)從培養(yǎng)好的菌種中均勻的截取Φ=9 mm的菌塊，取3個(gè)菌塊接種在培養(yǎng)基中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各做3個(gè)平行，對照實(shí)驗(yàn)加入500 μL無菌水.將接種完的培養(yǎng)皿放入30 ℃的條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，每隔24 h觀察菌塊，用十字交叉法測量菌塊的直徑并記錄.

2.2.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用菌絲生長速率法計(jì)算菌絲生長抑制率[17-18].記對照平板培養(yǎng)基菌落直徑為Ra，處理平板培養(yǎng)基菌落直徑為Rb，則

2.2.5 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.5.1 不同溫度處理后的香樟樹葉水提物對三七根腐病菌的抑制效果研究

取室溫提取的香樟樹葉水提物(A組)做如下處理：

B組：將A組水提物放入圓底燒瓶在60 ℃水浴鍋中水浴30 min；

C組：將A組水提物放入圓底燒瓶在90 ℃水浴鍋中水浴30 min；

D組：將A組水提物放入高壓蒸汽滅菌鍋在121 ℃處理30 min；

將香樟樹葉室溫水提物以及經(jīng)過60 ℃水浴、90 ℃水浴、121 ℃處理的室溫水提物各取500 μL分別進(jìn)行抑菌試驗(yàn).

2.2.5.2 不同方法提取的香樟樹葉水提物對三七根腐病菌的抑制效果研究

將香樟樹葉室溫水提物、80 ℃水提物和香樟樹葉揮發(fā)油各取500 μL分別進(jìn)行抑菌試驗(yàn).

3 結(jié)果與分析

3.1 不同溫度處理后得到的香樟樹葉水提物對三七根腐病菌的抑制效果

3.1.1 對尖孢鐮刀菌的抑制效果

取香樟樹葉室溫水提物以及進(jìn)行60 ℃水浴、90 ℃水浴和121 ℃處理后得到的香樟樹葉水提物對尖孢鐮刀菌作抑菌試驗(yàn)，抑制效果如圖1.

圖1 不同溫度處理后得到的香樟樹葉水提液對尖孢鐮刀菌的抑制效果

由圖1可看出，不同條件處理所得香樟樹葉水提物對尖孢鐮刀菌呈現(xiàn)出不同的抑制效果，且隨著時(shí)間的增加，抑制能力逐漸增強(qiáng).經(jīng)過60 ℃處理后得到的香樟樹葉水提物抑制作用最好，第4天抑菌率達(dá)到63.45%；第4天時(shí)，未經(jīng)處理的室溫水提物抑制作用比經(jīng)過90 ℃處理的香樟樹葉水提物抑制作用略好，未經(jīng)處理的室溫水提物抑菌率達(dá)到47.69%，經(jīng)90 ℃處理的香樟樹葉水提物抑菌率達(dá)到41.18%；經(jīng)過121 ℃處理的香樟樹葉水提物對尖孢鐮刀菌無明顯的抑制作用.

3.1.2 對腐皮鐮孢菌的抑制效果

取香樟樹葉室溫水提物及進(jìn)行60 ℃水浴、90 ℃水浴、121 ℃處理后得到的香樟樹葉水提物對腐皮鐮孢菌作抑菌試驗(yàn)，抑制效果如圖2.

圖2 不同溫度處理得到的香樟樹葉水提液對腐皮鐮孢菌的抑制效果

由圖2可看出，未經(jīng)處理的室溫水提物與經(jīng)60 ℃、90 ℃和121 ℃處理后的香樟樹葉水提物對腐皮鐮孢菌呈現(xiàn)不同的抑制效果.經(jīng)過90 ℃處理后得到的香樟樹葉水提物抑制作用最好，第4天抑菌率達(dá)到69.05%；經(jīng)過60 ℃處理的香樟樹葉水提物的抑制效果與未經(jīng)處理的室溫水提物的抑制效果相近，第4天抑菌率分別達(dá)到42.86%和41.67%；但經(jīng)過121 ℃處理后的香樟樹葉水提物對尖孢鐮刀菌無明顯的抑制作用.

不同溫度處理的香樟樹葉水提物對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌呈現(xiàn)不同的抑菌效果，原因可能是在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高，原提取液中某些物質(zhì)被分解為抑菌成分，但隨著溫度的繼續(xù)升高，抑菌活性物質(zhì)被破壞.

3.2 不同方法提取的香樟樹葉水提物對三七根腐病菌的抑制效果

3.2.1 對尖孢鐮刀菌的抑制效果

取香樟樹葉室溫水提物、80 ℃水提物和香樟樹葉揮發(fā)油對尖孢鐮刀菌作抑菌試驗(yàn)，抑制效果如圖3.

圖3 香樟樹葉提取物對尖孢鐮刀菌的抑制效果

由圖3看出，室溫水提物、80 ℃水提物和香樟樹葉揮發(fā)油對尖孢鐮刀菌呈現(xiàn)不同的抑制作用，隨著時(shí)間的增加，香樟樹葉揮發(fā)油和室溫水提物抑菌作用逐漸增強(qiáng).其中，抑菌效果最好的為香樟樹葉揮發(fā)油，第4天抑菌率達(dá)到77.31%；室溫水提物的抑菌率明顯高于80 ℃水提物的抑菌率，二者第4天時(shí)抑菌率分別為47.69%和27.52%.

3.2.2 對腐皮鐮孢菌的抑制效果

取香樟樹葉室溫水提物、80 ℃水提物和香樟樹葉揮發(fā)油對腐皮鐮孢菌作抑菌試驗(yàn)，抑制效果如圖4.

圖4 香樟樹葉提取物對腐皮鐮孢菌的抑制效果

由圖4看出，室溫水提物、80 ℃水提物和香樟樹葉揮發(fā)油對腐皮鐮孢菌呈現(xiàn)不同的抑制效果，香樟樹葉揮發(fā)油和80 ℃水提物抑菌率隨著時(shí)間的增加而增大.香樟樹葉揮發(fā)油對腐皮鐮孢菌呈現(xiàn)出最好的抑制作用，第4天抑制率達(dá)到74.29%；室溫水提物的抑制作用與80 ℃水提液的抑制作用相近，第4天抑制率分別為42.86%和41.43%.

香樟樹葉室溫水提物、80 ℃水提物和香樟樹葉揮發(fā)油對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌呈現(xiàn)不同的抑菌能力，其原因可能是不同條件得到的香樟樹葉水提物的抑菌活性物質(zhì)成分含量有差異.香樟樹葉中提取的揮發(fā)油對三七根腐病病菌的抑制作用最好，可能是揮發(fā)油中含有較高的抑菌活性成分.上述實(shí)驗(yàn)表明，香樟樹葉內(nèi)含有天然抑菌活性成分，在實(shí)際農(nóng)業(yè)種植病害防治中，可以添加適量的香樟樹葉水提液來防治三七根腐病.

4 結(jié)語

實(shí)驗(yàn)研究了香樟樹葉水提物對三七根腐病菌的抑制作用，設(shè)計(jì)了不同方法提取的和不同溫度處理后的香樟樹葉水提物對三七根腐病原菌中的尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的抑制試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:

(1)經(jīng)過60 ℃處理后得到的香樟樹葉室溫水提物對尖孢鐮刀菌抑制作用最好，抑菌率達(dá)到63.45%；經(jīng)90 ℃處理后得到的香樟樹葉室溫水提物對腐皮鐮孢菌抑制作用最好，抑菌率達(dá)到69.05%，而121 ℃處理后的香樟樹葉室溫水提物對三七根腐病菌的抑制作用很小.

(2)香樟樹葉揮發(fā)油對尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的抑菌試驗(yàn)呈現(xiàn)出最好的抑制效果，抑菌率分別達(dá)到77.31%和74.29%；室溫水提物對三七根腐病菌的抑制效果比80 ℃水提物略好，抑制率分別達(dá)到42.86%和41.43%.說明不同條件得到的香樟樹葉提取物對三七根腐病菌有不同的抑制效果.

本實(shí)驗(yàn)充分說明了香樟樹葉提取物對三七根腐病菌有很好的抑菌效果，為植物農(nóng)藥的開發(fā)奠定一定的基礎(chǔ).