呂 敏, 陳令新,2,3*

(1. 中國科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所, 山東 煙臺(tái) 264003;2. 山東省海岸帶環(huán)境過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 煙臺(tái) 264003; 3. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071)

抗生素是指能在低濃度下有選擇性地抑制或影響其他生物功能的一類物質(zhì),包括生物產(chǎn)生的和人工合成的[1]。抗生素被譽(yù)為20世紀(jì)最重要的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)之一。在世界范圍內(nèi),每年有越來越多的抗生素被人工合成,而且抗生素的消費(fèi)使用量也在逐年增加,預(yù)計(jì)至2030年畜用抗生素消費(fèi)使用量將比2011年增加67%[2]。由于大部分抗生素不能被人體或動(dòng)物代謝,通過排泄物的形式排出體外[3],最終通過地表徑流進(jìn)入到近海環(huán)境中。已有研究顯示一些抗生素可在魚類等生物體內(nèi)富集,具有生物放大效應(yīng)[4],威脅生態(tài)安全和人類健康。另外,抗生素會(huì)引發(fā)細(xì)菌耐藥性,并造成耐藥性的傳播[5]。因此,亟須掌握抗生素在環(huán)境中的行為及其環(huán)境效應(yīng),其中,建立環(huán)境中抗生素的分析方法成為關(guān)鍵。

由于抗生素在環(huán)境中的存在水平較低[6-8],通常用高靈敏度和高選擇性的液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)進(jìn)行檢測分析。而樣品前處理過程會(huì)直接影響儀器檢測的靈敏度和穩(wěn)定性,因此,發(fā)展各種環(huán)境基質(zhì)中樣品的前處理方法極為重要。目前已有環(huán)境水體[9]、魚體內(nèi)[10]抗生素分析樣品前處理方法的綜述,也有對近海包括抗生素等藥品和個(gè)人護(hù)理用品存在水平的文獻(xiàn)回顧[8],然而尚缺乏對近海各種介質(zhì)中抗生素分析樣品前處理方法的文獻(xiàn)綜述。本文將對近十幾年近海水體、沉積物和生物樣品中抗生素測定的前處理方法進(jìn)行回顧總結(jié),并著重介紹了固相萃取(SPE)、固液萃取、基質(zhì)固相分散萃取(MSPD)和QuEChERS等幾種常用前處理技術(shù)。

1 海水中抗生素分析的樣品前處理

由于抗生素在海水中的存在水平低,且海水基質(zhì)復(fù)雜,因此,針對海水樣品的前處理方法均是為了去除基質(zhì)干擾以及富集目標(biāo)物。目前水樣中研究較多的抗生素包括磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類,另外,甲氧芐氨嘧啶因與磺胺類抗生素一起使用[11],也是研究較多的抗生素。

1.1 預(yù)處理

水樣一般會(huì)首先過濾去除顆粒物,其中,0.45 μm或0.7 μm的玻璃纖維濾膜使用較多[11-23],也有研究采用1 μm甚至更大孔徑的玻璃纖維濾膜[24,25]或其他濾膜[26-28]。因此,這些方法測定的為溶解態(tài)的抗生素?？紤]到重金屬可與四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素發(fā)生絡(luò)合作用[29],因此,萃取時(shí)常用EDTA絡(luò)合重金屬,可有效提高抗生素的萃取效率[30,31]。

另外,抗生素結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,通常具有酸性或堿性官能團(tuán),而在溶液中不同的存在狀態(tài)直接影響其后續(xù)富集凈化過程中的保留行為,因此,溶液pH也是影響其后續(xù)回收率的關(guān)鍵因素。在中性條件下,酸性化合物以解離狀態(tài)存在,可以與環(huán)境基質(zhì)中質(zhì)子化的氨基官能團(tuán)作用,而堿性化合物可以與環(huán)境基質(zhì)中去質(zhì)子化的酸性官能團(tuán)作用,影響萃取效率;在堿性條件下,仲氨基H+解離程度提高,萃取效率會(huì)比中性條件下更低;而在低pH條件下,酸性化合物以分子狀態(tài)存在,堿性化合物以中性或者陽離子狀態(tài)存在,與基質(zhì)作用減弱,萃取效率會(huì)提升[32]。因此,對于大多數(shù)抗生素,酸性條件有利于它們的萃取。然而,有研究顯示,酸性或堿性條件下一些β-內(nèi)酰胺類和頭孢菌素類抗生素容易發(fā)生降解,進(jìn)而導(dǎo)致回收率偏低[9]。Gulkowska等[33]在分析大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類和頭孢菌素類抗生素時(shí),將樣品分成兩份,測β-內(nèi)酰胺類和頭孢菌素類抗生素時(shí),將水樣調(diào)至中性,而將另一份水樣調(diào)至酸性以測其他抗生素,最后得到較好的回收率。然而,該方法工作量較大,Zou等[13]在測定包括β-內(nèi)酰胺類和頭孢菌素類在內(nèi)的21種抗生素時(shí),將水樣酸化至pH=3,實(shí)現(xiàn)了多組分抗生素的同時(shí)分析,雖然回收率有所降低,但仍在可接受范圍內(nèi),且該方法更簡便。值得注意的是,有些抗生素如四環(huán)素在較低pH條件下(pH<2)不穩(wěn)定[29],通常將pH調(diào)到2～4之間。

1.2 固相萃取

與傳統(tǒng)液液萃取相比,SPE更省時(shí)省力、耗費(fèi)溶劑較少,且在多組分同時(shí)分析方面具有更好的重現(xiàn)性和選擇性,已經(jīng)成為水樣中抗生素富集凈化的經(jīng)典方法。要想獲得較好的富集凈化效果,SPE柱填料成為關(guān)鍵。親水疏水反向平衡柱(HLB)因可同時(shí)富集凈化極性和非極性的化合物,且可耐受較寬pH范圍(1～14)而常用于各種酸性、中性和堿性化合物的前處理分析。特別地,因HLB小柱不含有硅醇基,因此較適合四環(huán)素類抗生素,不會(huì)造成后續(xù)測定過程中峰拖尾現(xiàn)象[9]。在相同中性條件下,相比于HLB,也有研究發(fā)現(xiàn)將混合型陽離子交換柱(MCX)和HLB串聯(lián)起來使用可使磺胺醋酰、磺胺嘧啶和磺胺噻唑等磺胺類抗生素的回收率由66.8%、64.2%和51.3%分別提高到88.9%、88.9%和67.4%[26]。理論上,MCX材料既具有反相柱的特點(diǎn),又具有陽離子交換的優(yōu)勢,酸性條件更利于其對化合物的萃取。原因是,在低pH條件下(2.5～3),由于堿性化合物帶正電,可強(qiáng)烈結(jié)合到陽離子交換劑上,而中性和酸性化合物可被反相材料較好地保留,所以堿性、酸性和中性化合物都可以有效保留在MCX材料上。

大多數(shù)研究后續(xù)用水、低濃度的甲醇水溶液或非極性的正己烷進(jìn)行沖洗柱子,以去除EDTA以及干擾組分,待柱子抽干后,采用甲醇、酸化的甲醇或乙腈進(jìn)行洗脫。當(dāng)有其他化合物與抗生素一起分析時(shí),甲醇洗脫后,也會(huì)根據(jù)化合物性質(zhì)后續(xù)用別的溶劑進(jìn)一步洗脫[34]。近海海水中抗生素測定的前處理方法見表1。需要注意的是,由于一些抗生素易發(fā)生光降解,因此,收集的樣品包括前面采集樣品一般會(huì)儲(chǔ)放在棕色瓶中。而且,與淡水水體中抗生素樣品的前處理方法[35]相比,整體流程類似。

2 沉積物和生物樣品中抗生素分析樣品的前處理

對于沉積物和生物樣品,基質(zhì)比水體更為復(fù)雜,處理過程也更為繁瑣。對于生物血樣,離心取血漿后,用甲酸水溶液稀釋定容,然后過HLB小柱,用甲醇洗脫[36,37]。對于固體樣品,首先需要通過超聲、微波、振蕩或者加速溶劑萃取(ASE)把抗生素從基質(zhì)中提取出來[15,18-21,23,24,38-51],進(jìn)一步進(jìn)行凈化。近年來,很多學(xué)者發(fā)展出更簡便的方法,如MSPD[52,53]和QuEChERS方法[25,54-57],特別是QuEChERS方法,耗時(shí)更短。

2.1 預(yù)處理

沉積物樣品一般需要冷凍干燥,后續(xù)研磨過篩沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),篩子孔徑從0.15 mm到2 mm均有報(bào)道。考慮到不同粒徑的顆粒對污染物的吸附能力不同,在比較不同研究污染物存在水平時(shí)篩孔直徑也不能忽視。

對于生物樣品,血樣一般離心,冷凍保存;其他一般取肌肉等生物組織樣品,如對雙殼貝類生物去殼,然后勻質(zhì)化,經(jīng)冷凍干燥或不經(jīng)冷凍干燥直接冷凍保存。

2.2 固液提取

固液提取是向固體樣品中加入提取溶劑,通過超聲、振蕩、加速溶劑萃取等方法將目標(biāo)物從固體樣品中提取出來,該法因操作簡單且過程中不需要貴重儀器而成為應(yīng)用最多的一種經(jīng)典前處理方法,但該方法后續(xù)通常會(huì)與SPE技術(shù)相結(jié)合,以進(jìn)一步凈化(見表2)。

提取溶劑是影響目標(biāo)物回收率的關(guān)鍵,常用提取溶劑包括乙腈、甲醇、乙酸乙酯、酸化的乙腈或甲醇,以及甲醇-水、甲醇-乙腈等混合溶劑。McIlvaine/EDTA水溶液(pH 4)對四環(huán)素類抗生素有很高的溶解性,常用于從固體樣品中提取四環(huán)素[29]。在所有的提取溶劑中,乙腈因?yàn)檩^低的基質(zhì)干擾效應(yīng)被認(rèn)為是較優(yōu)的選擇,但它對有些抗生素如阿莫西林的萃取效率較低[46]。盡管如此,Freitas等[47]比較了乙腈、甲醇以及混合溶劑對生物體中41種抗生素包括磺胺類、甲氧芐氨嘧啶、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、青霉素類和氯霉素類等7大類抗生素的處理效率,發(fā)現(xiàn)相對于其他溶劑體系,乙腈對目標(biāo)抗生素的整體回收率最好,且不需要進(jìn)一步SPE凈化,快速方便。相比之下,甲醇會(huì)提取到較多的極性雜質(zhì),因此,很多學(xué)者會(huì)采用一定比例的甲醇水或甲醇-乙腈溶液作為萃取溶劑[40,57]。

與β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類和氟喹諾酮類等抗生素相比,針對氨基糖苷類抗生素的檢測分析報(bào)道較少。一個(gè)主要原因是,氨基糖苷類抗生素在酸性條件下具有較強(qiáng)的極性和穩(wěn)定性,需要高離子強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行提取。Gbylik等[44]研究了魚體中包括氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、氟喹諾酮類和甲氧芐氨嘧啶類共34種抗生素的分析方法,提出分別用偏磷酸和七氟丁酸組成的離子對試劑和乙腈提取,最后混合可以使目標(biāo)抗生素有較好的回收率,且應(yīng)先采用離子溶劑提取,否則會(huì)導(dǎo)致氨基糖苷類抗生素回收率的降低。

生物樣品中因含有較多的蛋白質(zhì),常加入乙腈、甲醇、丙酮或者這些溶劑與酸類物質(zhì)包括三氯乙酸(TCA)、三氟乙酸、乙酸、檸檬酸和甲酸等的混合物,以促使蛋白質(zhì)沉淀;另外,McIlvaine-EDTA、檸檬酸鈉、草酸鹽、磷酸鹽緩沖液等也可以作為蛋白質(zhì)去除劑[58]。針對四環(huán)素類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素,也需要加入重金屬絡(luò)合劑以提高目標(biāo)物的提取效率。Gbylik等[44]測定魚體內(nèi)抗生素時(shí),分別加入EDTA和20%三氯乙酸溶液以分別絡(luò)合重金屬、促進(jìn)蛋白質(zhì)的沉淀。

根據(jù)樣品中目標(biāo)物提取的情況,往往需要對提取液進(jìn)一步做凈化處理。常用步驟是通過旋蒸去除提取液中的有機(jī)溶劑,然后同水樣處理方法,進(jìn)一步采用SPE進(jìn)行濃縮凈化。由于沉積物或生物樣品基質(zhì)比水體更為復(fù)雜,有研究[15,23]在HLB柱前串聯(lián)強(qiáng)陰離子交換柱(SAX)以去除基質(zhì)中的腐殖質(zhì),降低基質(zhì)效應(yīng)。由于生物樣品脂肪含量較高,且正己烷可溶解脂類物質(zhì),而不能溶解抗生素,因此,也可用它進(jìn)行樣品凈化[43]。

2.3 MSPD

MSPD第一步通常是將樣品和吸附劑用研缽研磨混勻,然后將其放入帶篩板的空柱子里,用溶劑進(jìn)行洗脫。MSPD方法后面的洗脫過程與SPE類似,但MSPD方法洗脫過程中樣品與溶劑接觸面積更大。MSPD因所用樣品和溶劑量比較少,近年來已廣泛用于污泥、食品等固體和半固體樣品中農(nóng)藥等有機(jī)污染物的前處理[59-61],目前用于近海環(huán)境中抗生素分析樣品前處理的研究較少(見表2)。

樣品量跟吸附劑量的比例與樣品種類和含水量有關(guān),含水量較高的樣品所需吸附劑的比例通常也較高。吸附劑、洗脫溶劑的選擇均會(huì)影響基質(zhì)去除以及目標(biāo)物的回收率。對于四環(huán)素類等抗生素,在研磨過程中也會(huì)加入EDTA以絡(luò)合重金屬[52]。Villar-Pulido等[54]采用氨丙基材料Bondesil-NH2和乙腈分別作吸附劑和洗脫溶劑測定蝦中的抗生素,磺胺類抗生素的回收率大部分低于40%。Shen等[53]研究了不同吸附劑(十八烷基(C18)、中性氧化鋁、HLB材料和多壁碳納米管)和洗脫溶劑(不同比例的甲醇氨水溶液)對魚肉中14種磺胺類抗生素的前處理效果,發(fā)現(xiàn)HLB材料效果最好,其次是中性氧化鋁,而C18對大部分磺胺類抗生素均有較好的效果(因?qū)Π被交酋０肪哂休^強(qiáng)的親水性,回收率較低),所用洗脫溶劑均能較好地將目標(biāo)物洗脫下來,但含甲醇多的洗脫溶劑會(huì)造成基質(zhì)效應(yīng)增大,因此,選擇適當(dāng)配比的甲醇氨水溶液會(huì)取得較好的效果。另外,有學(xué)者在對柱子洗脫前采用正己烷淋洗柱子以去除脂溶性雜質(zhì),降低基質(zhì)效應(yīng)[52]。

2.4 QuEChERS方法

QuEChERS方法最早提出于2003年,因具有快速(quick)、簡單(easy)、廉價(jià)(cheap)、有效(effective)、可靠(rugged)和安全(safe)的特點(diǎn)而得名[62]。該方法通常是取一定量樣品至離心管中,如果是干樣,萃取前需要加水,接著加入乙腈等溶劑,振蕩或超聲提取,然后加入無水MgSO4和NaCl,立刻振蕩,使水相和有機(jī)相分離,并將目標(biāo)物從水相提取到有機(jī)相中;離心取有機(jī)相,后續(xù)通常會(huì)通過分散固相萃取(d-SPE)進(jìn)一步凈化,具體是將提取液加入含有PSA(primary secondary amine)等吸附劑和無水MgSO4的離心管中;振蕩離心后取上清液可直接上機(jī)測定。在該方法中,添加NaCl可以去除水溶性較高的極性干擾基質(zhì),同時(shí)加入MgSO4和NaCl可促使水相和有機(jī)相的分離,且鹽的存在可降低極性物質(zhì)的溶解度,所以該方法對極性物質(zhì)也有較高的回收率。PSA吸附劑作為弱離子交換劑,可以與提取液中的酸性脂肪酸等雜質(zhì)作用,達(dá)到凈化的目的;MgSO4可以去除提取液中的水分,進(jìn)而可以促使PSA去除酸類雜質(zhì)。

QuEChERS已被廣泛用于各種樣品中農(nóng)藥的前處理分析[63-67],近年來,有研究學(xué)者開始將該方法用于樣品中抗生素的處理[68-70](見表2)。而根據(jù)目標(biāo)物和基質(zhì)的不同,萃取體系及吸附材料往往也需進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化。針對蝦中的磺胺類和嘧啶類抗生素,Villar-Pulido等[54]采用乙酸酸化的乙腈提取后,加1.75 g NaCl和4 g MgSO4進(jìn)行鹽析分層,然后向乙腈相中加入250 mg PSA和750 mg無水MgSO4通過d-SPE進(jìn)一步凈化。而對于懸浮顆粒物中的磺胺類和嘧啶類抗生素,Cantwell等[25]采用乙酸-乙酸鈉酸化的乙腈提取,并用3 g MgSO4進(jìn)行鹽析分層,取乙腈相濃縮后直接上機(jī)測定,并未經(jīng)過d-SPE進(jìn)一步凈化。針對魚體內(nèi)的四環(huán)素類抗生素,Grande-Martinez等[57]采用EDTA-McIlvaine緩沖液和乙腈溶液進(jìn)行提取,加(NH4)2SO4進(jìn)行鹽析,并采用C18經(jīng)過d-SPE進(jìn)一步凈化。由于d-SPE過程中的吸附材料最終要通過離心或過濾丟棄,且與SPE過程相比,丟掉的吸附材料上仍會(huì)殘留較多目標(biāo)化合物,造成回收率的偏低。據(jù)研究,PSA、C18以及硅膠、氧化鋁等一些吸附材料,可造成一些喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類抗生素回收率偏低[71,72]。因此,有學(xué)者通過加入正己烷對萃取后的有機(jī)相進(jìn)一步凈化[55]。

3 結(jié)論與展望

整體上,目前近海環(huán)境關(guān)注的抗生素種類有限,且多局限于磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,未來需關(guān)注其他抗生素。相比較而言,近海水相中抗生素的前處理方法較成熟,也有基于SPE的Online-SPE在線前處理系統(tǒng),可與LC-MS/MS直接相連,實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。沉積物和生物樣品因基質(zhì)更為復(fù)雜,在提取目標(biāo)物的同時(shí)去除基質(zhì)干擾也成為關(guān)鍵。固液萃取、MSPD和QuEChERS方法是目前常用的3種固體樣品前處理技術(shù)。其中,固液萃取應(yīng)用較多,但其所需溶劑較多,操作步驟較為繁瑣。MSPD技術(shù)所需溶劑和樣品量均較少,但因研磨和裝柱過程中操作上的差異容易造成重現(xiàn)性差,且面臨著無法自動(dòng)化的問題。QuEChERS方法目前已有針對特定目標(biāo)物的市場化產(chǎn)品,但在抗生素分析樣品前處理方面研究較少?？紤]到有些抗生素極性較大,最后d-SPE所用吸附劑需要謹(jǐn)慎選擇,PSA因?qū)O性物質(zhì)具有吸附作用會(huì)造成回收率的降低。其他材料如磁性材料通過將目標(biāo)物吸附到表面,在外部磁場作用下使目標(biāo)化合物與基質(zhì)分離,具有富集效率高、分離過程簡便等優(yōu)點(diǎn),具有良好的應(yīng)用前景。另外,分子印跡材料因具有高選擇性,可有針對性地對某種或某類物質(zhì)進(jìn)行吸附,相比于C18、PSA等具有較廣吸附范圍的材料,分子印跡材料在目標(biāo)物萃取或者凈化方面可能是一個(gè)較好的選擇。