孫曉宇, 馬潤恬, 師彥平*

(1. 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730000; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technology, MIT)是為獲得與某一特定目標(biāo)分子在空間形狀、大小和官能團(tuán)相互匹配的分子印跡聚合物(molecular imprinted polymers, MIPs)的材料制備技術(shù),其工作原理可被形象地描述為“鎖鑰原理”[1-3]。

MIPs的制備是在模板分子的引導(dǎo)下,首先使模板分子與功能單體進(jìn)行預(yù)組裝,然后在交聯(lián)劑的作用下,固定模板分子與功能單體形成的預(yù)組裝體系,形成聚合物。通過洗脫聚合物,將其內(nèi)部的模板分子除去,在聚合物內(nèi)部留下與模板分子大小、形狀和官能團(tuán)相互匹配的印跡空穴(見圖1)。當(dāng)MIPs再次吸附模板分子時,印跡空穴可通過形狀匹配和官能團(tuán)間的靜電作用、氫鍵作用、疏水作用等相互作用,實(shí)現(xiàn)對模板分子的選擇性吸附。MIT現(xiàn)已被廣泛用于色譜分離[4]、分子識別[5]、生物傳感[6-8]和催化[9]等領(lǐng)域,尤其是將MIT與固相萃取技術(shù)相結(jié)合,賦予了固相萃取材料優(yōu)異的選擇性吸附能力[10,11],在生物大分子分離分析領(lǐng)域凸顯出巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖 1 MIPs制備流程Fig. 1 Procedure for the synthesis of MIPs

蛋白質(zhì)是維持生物生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ),對于維持生物體內(nèi)正常的生命活動至關(guān)重要。將MIT應(yīng)用于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)的研究,是近年來MIT應(yīng)用的主要方向之一。蛋白質(zhì)具有尺寸較大、構(gòu)型易變、物理及化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定等特性,使蛋白質(zhì)印跡一直面臨諸多的困難和挑戰(zhàn)[7,12,13]。近年來,新型分子印跡技術(shù),包括表面印跡、金屬螯合物印跡和抗原決定基印跡等技術(shù)的出現(xiàn),很大程度上解決了蛋白質(zhì)印跡困難的問題,推動了MIT在蛋白質(zhì)分離分析領(lǐng)域的應(yīng)用[4]。

1 MIPs的制備方法

MIPs的常規(guī)制備方法可分為本體聚合、懸浮聚合、乳液聚合和沉淀聚合等,上述方法在化學(xué)小分子印跡方面已日漸成熟,但對于印跡蛋白質(zhì)等生物大分子還存在極大困難。由于蛋白質(zhì)尺寸較大,采用本體聚合制備MIPs過程時,模板分子大都存在于聚合物內(nèi)部,使得模板分子洗脫效率過低。同時,MIPs高度交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),導(dǎo)致模板分子擴(kuò)散受到限制,致使MIPs對模板分子的吸附平衡時間較長。另外,傳統(tǒng)MIPs制備方法包括懸浮聚合、乳液聚合和本體聚合在MIPs的制備過程中需加入有機(jī)溶劑,易引起蛋白質(zhì)等生物大分子的變性、失活,使得采用上述方法制備的MIPs對模板分子的吸附效果不理想。表面印跡、金屬螯合物印跡和抗原決定基印跡分別通過將模板分子固定在載體表面、借助金屬離子與蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的螯合作用和以模板分子的特征片段為模板分子,在一定程度上解決了蛋白質(zhì)印跡過程中模板分子洗脫困難、傳質(zhì)速率過低和變性、失活等問題,促進(jìn)了蛋白質(zhì)印跡技術(shù)的發(fā)展。下面詳細(xì)介紹3種新型分子印跡技術(shù)。

1.1 表面印跡

表面印跡法[14]一般以物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、比表面積較大和易于修飾的球形或平面材料為支撐體,如SiO2納米粒子(nanoparticles, NPs)[15]、Fe3O4NPs[16,17]、量子點(diǎn)[18]、聚苯乙烯微球[19]、介孔硅膠[20]和石墨烯[21,22]等,對這類材料進(jìn)行表面修飾后,加入模板分子、功能單體和交聯(lián)劑,最后加入引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng),在材料表面構(gòu)建印跡殼層。由于聚合反應(yīng)發(fā)生在材料表面,形成的聚合物殼層相對較薄,縮短了模板分子的傳質(zhì)路徑,從而解決了模板分子洗脫困難、傳質(zhì)速率過低的問題,使其成為近年來蛋白質(zhì)印跡的主要方法。Wang等[23]以載玻片為支撐體,結(jié)合硼酸親和原理和表面印跡法,實(shí)現(xiàn)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)在玻璃基質(zhì)表面的印跡。硼酸配基在中性或弱堿性條件下,可與含有順式二羥基的糖蛋白形成可逆的共價鍵,當(dāng)外界環(huán)境為酸性時,該共價鍵自動斷裂,由此實(shí)現(xiàn)糖蛋白的靈活吸附和解離。該工作中以3-氨基苯硼酸(3-aminophenylboronic acid, APBA)為功能單體,可通過調(diào)控pH,實(shí)現(xiàn)模板分子的吸附與解離,簡化了模板分子的洗脫過程。另外,印跡過程中,以多巴胺和APBA同時為交聯(lián)劑,通過精確控制兩者的聚合時間,使印跡殼層厚度為模板分子尺寸的1/3與2/3之間,縮短了HRP的傳質(zhì)路徑,提高了HRP的洗脫和吸附效率(見圖2)。他們采用該表面印跡法在整體柱填料表面印跡轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin, Trf),成功實(shí)現(xiàn)了血清中Trf的選擇性識別與分離。

圖 2 表面印跡示意圖[23]Fig. 2 Schematic diagram for surface imprinting[23]

圖 3 中空型MIPs的制備[26]Fig. 3 Preparation of the hollow MIPs[26]SA: sialic acid; EGDMA: ethylene glycol dimethacrylate; AIBN: azobisisobutyronitrile; MeOH: methanol; AA: acrylic acid.

在表面印跡的基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用化學(xué)手段將MIPs的載體除去,形成中空型MIPs。與含有載體的MIPs相比,中空型MIPs內(nèi)、外兩側(cè)的三維印跡空穴可同時選擇性識別、吸附模板分子,由此提高M(jìn)IPs對模板分子的吸附效率。常被作為犧牲載體的材料有SiO2微球[24]、聚苯乙烯球和Fe3O4NPs[25]等,一般采用酸、堿和有機(jī)溶劑等方法將載體去除。如圖3所示,Huang等[26]以環(huán)氧基團(tuán)功能化介孔SiO2微球(glycidilmethacrylate modified MCM-48, MCM-48@GMA)作為載體,硼酸試劑為功能單體、唾液酸為模板分子,加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑,使聚合反應(yīng)在MCM-48表面發(fā)生,待反應(yīng)完成后,用氫氟酸(hydrofluoric acid, HF)和甲醇/乙酸分別將MCM-48和模板分子除去得到中空型MIPs。為賦予材料快速分離的優(yōu)勢,他們采用化學(xué)共沉淀方法制備Fe3O4NPs,并將其修飾在中空型MIPs表面,成功得到磁性中空型MIPs(boronate-affinity magnetic hollow molecularly imprinted polymers, B-MhMIPs)。他們將B-MhMIPs成功應(yīng)用于血清中唾液酸的分離分析,回收率達(dá)到70.9%～106.2%。

圖 4 抗原決定基印跡示意圖[27]Fig. 4 Schematic diagram for epitope imprinting[27]

1.2 抗原決定基印跡

抗原決定基印跡是通過模擬抗原-抗體復(fù)合物的結(jié)合形式,即抗體特異性的結(jié)合抗原的某一特征部位(抗原決定基)而建立起來的印跡方法。抗原決定基印跡以分析物的特征片段為模板分子制備MIPs,形成的三維印跡空穴對該特征片段和分析物均具有選擇性識別能力。該方法解決了生物大分子印跡過程中尺寸較大、構(gòu)型易變和物理化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的問題。Bie等[27]將核糖核酸酶B(ribonuclease B, RNase B)消化,以消化產(chǎn)物中某一特定多糖為模板分子,實(shí)現(xiàn)其在硼酸功能化磁性納米粒子(magnetic nanoparticle, MNP)表面的印跡。得到的多糖印跡MNP對RNase B表現(xiàn)出良好的吸附性能(見圖4)。他們將建立的方法用于Trf消化產(chǎn)物中某一特定多糖的印跡,成功實(shí)現(xiàn)了人血清中Trf的選擇性識別與分離。Zhao等[28]采用抗原決定基印跡法,以牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的C-終端肽為模板分子,Fe3O4@SiO2為載體,3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES)為功能單體,制得Fe3O4@EMIPs (magnetic epitope molecularly imprinted polymers),其對BSA的吸附容量和印跡因子(20.25 mg/g、3.21)均明顯優(yōu)于采用以BSA為模板分子制得的MIPs(13.06 mg/g、1.87)。

1.3 金屬螯合物印跡

金屬螯合物印跡主要用于印跡表面具有暴露的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。該方法在反應(yīng)試劑中加入金屬螯合單體和金屬離子,通過金屬離子與金屬螯合單體及目標(biāo)蛋白質(zhì)中氨基酸之間的結(jié)合作用,在交聯(lián)劑的作用下交聯(lián)聚合,形成聚合物。最后選擇合適的方法將聚合物內(nèi)部的模板分子洗脫,即得MIPs。金屬螯合作用強(qiáng)度優(yōu)于非共價鍵結(jié)合,有利于模板分子的固定。另外,使用EDTA或其他螯合劑可在較溫和的條件下除去模板分子,提高了模板分子洗脫效率。如圖5所示,Li等[29]以具有暴露組氨酸殘基的溶菌酶(lysozyme, Lys)為模板分子,甲基丙烯酸縮水甘油酯-亞氨基二乙酸(glycidyl methacrylate-iminodiacetic acid, GMA-IDA)為金屬螯合單體,加入Cu2+,使其與GMA-IDA和Lys分別進(jìn)行結(jié)合,在交聯(lián)劑和引發(fā)劑作用下,實(shí)現(xiàn)Lys-MIPs在功能化SiO2NPs表面的成功印跡。采用該方法制得的MIPs對Lys的吸附容量和印跡因子分別高達(dá)67.3 mg/g和22.7。他們還將該方法用于印跡血紅蛋白(hemoglobin, Hb),也取得了良好效果。Demirci等[30]采用金屬螯合物印跡法,以N-甲基丙烯酰氧基-L-組氨酸甲酯(N-methacryloyl-L-histidine methyl ester, MAH)為金屬螯合單體,使其與Cu2+形成復(fù)合物MAH-Cu2+。該復(fù)合物與蛋白質(zhì)C(protein C)結(jié)合形成MAH-Cu2+-protein C,與交聯(lián)劑混合后將其加入到容積為5 mL的玻璃注射器中密封,于-12 ℃反應(yīng)24 h,反應(yīng)完成后采用適宜的方法將聚合物內(nèi)部的模板分子洗脫即得分子印跡冷凍凝膠。該分子印跡冷凍凝膠對protein C的吸附容量為30.4 mg/g,印跡因子為1.72。

圖 5 金屬螯合物印跡示意圖[29]Fig. 5 Schematic diagram for metal chelate imprinting[29]MEO2MA: di(ethylene glycol) methyl ether methacrylate; MBA: N,N-methylenebis(acrylamide); His: histidine; AAM: acrylamide.

2 MIT在蛋白質(zhì)分離分析中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)等生物大分子是維持生物體正常生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ),也是細(xì)胞的重要組成部分,實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的有效分析,對生物醫(yī)學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)均具有重要意義。但蛋白質(zhì)往往存在于基質(zhì)復(fù)雜的生物樣品中,難以實(shí)現(xiàn)對其直接分析檢測。因此建立選擇性好、穩(wěn)定性高和操作簡便的分離分析方法是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)有效檢測的重要前提。采用MIT制備的MIPs具有較高的選擇性、親和性和穩(wěn)定性,可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中目標(biāo)物的選擇性識別與分離。雖然以蛋白質(zhì)為模板分子的MIT一直面臨諸多困難和挑戰(zhàn),但近年來隨著表面印跡、抗原決定基印跡和金屬螯合物印跡等新型印跡技術(shù)的出現(xiàn),MIT在蛋白質(zhì)分離分析中逐漸顯示出良好的發(fā)展前景。

Xu等[31]以牛血紅蛋白(bovine hemoglobin, BHb)為模板分子,以基于乙烯基的低共熔溶劑為功能單體,N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N-methylenebisacrylamide, MBAA)為交聯(lián)劑,采用表面印跡技術(shù),在乙烯基三乙氧基硅烷(vinyltriethoxysilane, VTEO)修飾的Fe3O4磁性載體(Fe3O4@VTEO)表面構(gòu)建印跡殼層,制得MIPs。該MIPs對BHb具有較高的吸附容量(164.20 mg/g)和良好的選擇性(印跡因子為4.93)。同時,他們將該MIPs成功用于選擇性識別與分離牛血液中的BHb,效果良好。Zhang等[32]采用表面印跡法,以大孔SiO2為載體,BSA為模板分子,分別借助APTES和辛基三甲氧基硅烷與BSA間的氫鍵和疏水作用,制得大孔硅納米印跡顆粒(molecular imprinted large-pore silica particles, MI-LPSPs),其對BSA吸附容量高達(dá)162.82 mg/g。他們將MI-LPSPs用于萃取血液中的BSA,結(jié)果證明,MI-LPSPs可選擇性識別與分離其中的BSA。Zhou等[33]以中空Fe3O4微球?yàn)檩d體,在N-異丙基丙烯酰胺(N-isopropyl acrylamide, NIPAM)、甲基丙烯酸(methacrylic acid, MAA)和MBAA的共同作用下,制得BSA表面印跡的溫敏型MIPs。吸附試驗(yàn)表明,MIPs在32 ℃時對BSA的吸附容量(430.67 mg/g)和選擇性(2.01)最佳。Fan等[34]以碳碳雙鍵功能化的Fe3O4@SiO2為載體,BSA為模板分子,在MAA、NIPAM、基于雙鍵的離子液體和MBAA的共同作用下交聯(lián)聚合,待聚合反應(yīng)完成后,使用HF將載體中的SiO2殼層刻蝕,得到撥浪鼓形MIPs。該MIPs被成功應(yīng)用于選擇性識別與分離小牛血清中的BSA,其對模板分子的吸附容量和印跡因子分別為130.19 mg/g和2.79。

除采用表面印跡法印跡蛋白質(zhì),抗原決定基印跡法也是用于印跡蛋白質(zhì)的常用方法。Qin等[35]采用抗原決定基印跡法,以豬血清白蛋白(pork serum albumin, PSA)的C-終端肽和N-終端肽同時作為模板分子,在磁性碳納米管(magnetic carbon nanotubes, MCNTs)表面制備得到分子印跡聚合物(magnetic carbon nanotubes coated by dual-template epitope imprinting polymer, MCNTs@D-EMIP)。該印跡材料對豬血清中的PSA表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性識別分離能力,其對PSA的吸附容量和印跡因子分別為45.05 mg/g和4.50。另外,Bakhshpour等[36]還利用金屬螯合物印跡法,在納米纖維素表面合成Hb印跡的薄膜,該印跡薄膜對Hb的吸附容量高達(dá)208.39 mg/g,成功實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞裂解液中Hb的選擇性識別與分離。Dolak等[37]采用金屬螯合物印跡法,以N-乙?；窠?jīng)氨酸為替代模板分子,制備對血漿銅藍(lán)蛋白具有選擇性吸附能力的印跡凝膠,并將其用于選擇性識別與分離血清中的銅藍(lán)蛋白,效果良好。為更直觀地了解MIT在蛋白質(zhì)分離分析領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀,我們將近3年來MIT在蛋白質(zhì)分離分析領(lǐng)域的應(yīng)用情況匯總在表1中。

糖蛋白是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要產(chǎn)物,其變化與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前,已有多種糖蛋白被用作臨床診斷的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),因此,實(shí)現(xiàn)糖蛋白的高效分離分析具有十分重要的臨床應(yīng)用價值。近年來,基于硼酸親和作用的MIPs憑借其對糖蛋白的可逆結(jié)合能力和形狀記憶能力,成為糖蛋白分離分析的主要工具之一。Luo等[60]采用表面印跡技術(shù),以氧化石墨烯(graphene oxide, GO)為載體,卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)為模板分子,APBA為功能單體,結(jié)合溶膠-凝膠法,在GO表面構(gòu)建MIPs,所得材料對OVA的吸附容量高達(dá)278 mg/g,印跡因子為9.5。他們將該MIPs應(yīng)用于雞蛋清中OVA的選擇性識別與分離,取得了良好效果。為提高M(jìn)IPs對模板分子的吸附效率,Bie等[61]采用抗原決定基印跡法,以糖蛋白的特征片段為模板分子, 2,4-二氟-3-甲?；脚鹚釣楣δ軉误w,通過精確控制交聯(lián)劑正硅酸乙酯(tetraethylorthosilicate, TEOS)的水解時間,制得具有適宜印跡層厚度的MIPs殼層,縮短了模板分子傳質(zhì)路徑,提高了MIPs對模板分子的吸附效率,并成功實(shí)現(xiàn)了人血清中目標(biāo)物的選擇性識別與分離。為進(jìn)一步提高糖蛋白的洗脫效率,Xie等[62]以2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯和4-乙烯基苯硼酸同時作為pH響應(yīng)型功能單體,功能化Fe3O4為磁性載體,OVA為模板分子,制得基于硼酸親和作用的pH響應(yīng)型MIPs。該印跡材料可在10 min內(nèi)對OVA達(dá)到吸附飽和,吸附容量為81.2 mg/g。將其應(yīng)用于人血清中加標(biāo)OVA的選擇性萃取,加標(biāo)回收率為92.9%～95.8%。Zhu等[63]以功能化的磁性Fe3O4為載體,OVA為模板分子,通過開環(huán)反應(yīng)將1,6-己二胺和APBA同時修飾在磁性載體表面,制得對OVA具有選擇性識別能力的MIPs。該MIPs在pH=7.4時對目標(biāo)糖蛋白具有較高的吸附容量(190.7 mg/g)和良好的選擇性(印跡因子為7.51)。他們將制得MIPs成功用于雞蛋清中OVA的選擇性識別與分離,效果良好。Qin等[59]結(jié)合抗原決定基印跡法、金屬螯合物印跡法和表面印跡法,同時以HSA和Trf的C-終端肽為模板分子,在MCNTs的表面構(gòu)建具有兩種識別位點(diǎn)的印跡殼層,得到的MIPs可同時選擇性識別吸附HSA和Trf兩種目標(biāo)物,吸附容量分別為103.67 mg/g和68.48 mg/g。

本課題組長期致力于MIT在糖蛋白分離分析中的探索與應(yīng)用。首先,為提高M(jìn)IPs對特定糖蛋白的吸附效率,Ma和Sun等[64]提出薄膜型磁性分子印跡納米粒子(magnetic molecularly imprinted nanoparticles, MMINs)的概念。即通過改進(jìn)Fe3O4NPs的制備方法,獲得單分散型磁性載體,在本質(zhì)上提高M(jìn)MINs的分散性,進(jìn)而為模板分子提供更多的有效印跡位點(diǎn)。另外,通過精確控制載體表面交聯(lián)劑的聚合反應(yīng)進(jìn)程,制得厚度接近模板糖蛋白直徑的MIPs薄膜,可有效縮短模板分子的傳質(zhì)路徑,提高M(jìn)MINs對模板分子的吸附及洗脫效率?；谏鲜鏊悸?我們分別以HRP和IgG為模板糖蛋白,制備出兩種MMINs,并將其分別用于復(fù)雜生物樣品中目標(biāo)糖蛋白的高選擇性識別與萃取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MMINs將傳統(tǒng)磁性MIPs對模板分子的吸附及洗脫時間由幾個小時縮短至35 min以內(nèi)。另外,我們在上述研究思路的基礎(chǔ)上同時以HRP和OVA兩種糖蛋白為模板分子[62],通過對兩種模板分子的用量進(jìn)行優(yōu)化,制得含有兩種印跡空穴的MMINs,其對HRP和OVA兩種糖蛋白均表現(xiàn)出良好的吸附性能。實(shí)際樣品分析結(jié)果表明,該MMINs可同時選擇性識別萃取復(fù)雜生物樣品中的HRP和OVA。

表 1 分子印跡技術(shù)在蛋白質(zhì)分離分析中的應(yīng)用

Q: adsorption capacity; IF: imprinting factor; Cyt C: cytochrome C; Con A: concanavalin A; HSA: human serum albumin; PMMA: poly(methyl methacrylate); -: no supports was used; /: the information was missing from the original reference.

為拓寬基于硼酸親和作用的MIPs的pH適用范圍,促進(jìn)其對弱酸性生物樣品中特定糖蛋白的有效分離分析,本課題組[65]以多孔TiO2(porous TiO2, pTiO2)包覆的Fe3O4(Fe3O4@pTiO2)為載體,在其表面修飾功能單體4-乙烯基苯硼酸,由此在載體表面形成Ti-O-B結(jié)構(gòu)。其中,pTiO2中Ti(Ⅳ)具有較強(qiáng)的吸電子能力,可降低4-乙烯基苯硼酸中硼原子的電子云密度,進(jìn)而降低4-乙烯基苯硼酸的pKa值,保證其在較低的pH條件下依然能與糖蛋白之間發(fā)生高效的硼酸親和作用。在此基礎(chǔ)上,我們以HRP為模板糖蛋白,在Fe3O4@pTiO2合成厚度約為10 nm的MIPs薄膜,制得弱酸性環(huán)境下適用的新型硼酸親和型磁性分子印跡聚合物(Fe3O4@pTiO2@MIPs)。最后,我們將其成功應(yīng)用于弱酸性尿液(pH=6.5)和弱堿性胎牛血清(pH=8.5)樣品中加標(biāo)HRP的快速高選擇性識別萃取,并結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)對結(jié)果進(jìn)行分析,效果良好。該工作首次將基于硼酸親和作用的MIPs適用范圍從pH 7.0～9.0拓寬至6.0～9.0,為實(shí)現(xiàn)弱酸性生物樣品中目標(biāo)糖蛋白的有效分離分析提供了新方法與新思路。

為進(jìn)一步了解MIT在糖蛋白分離分析中的應(yīng)用現(xiàn)狀,我們將近3年來MIT在糖蛋白分離分析中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)(見表2)。

表 2 分子印跡技術(shù)在糖蛋白分離分析中的應(yīng)用

AHSG: alpha-2-Heremans-Schmid glycoprotein; IgG: immunoglobulin G; PGMA: poly(glycidyl methacrylate); PSG: poly(styrene-glycidyl methacrylate).

3 結(jié)論與展望

隨著生物醫(yī)學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展,實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中蛋白質(zhì)的有效分離分析已成為蛋白質(zhì)研究的重要前提。分子印跡技術(shù)通過仿生原理實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的識別,具有優(yōu)良的選擇性和親和性,可實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜生物基質(zhì)中目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇性識別與分離,為蛋白質(zhì)的快速分析奠定了良好基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)尺寸較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、構(gòu)型易變和物理化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定等特性,使MIT在蛋白質(zhì)等生物大分子領(lǐng)域的應(yīng)用受到一定程度的限制。表面印跡、金屬螯合物印跡和抗原決定基印跡等新型印跡技術(shù)的出現(xiàn)解決了蛋白質(zhì)印跡過程中模板分子傳質(zhì)較慢、洗脫困難和易變性、失活等問題,使得MIT在蛋白質(zhì)分離分析領(lǐng)域顯示出良好的發(fā)展前景。今后,MIT在蛋白質(zhì)等生物大分子分離分析領(lǐng)域的研究主要集中于以下幾個方面。

(1)發(fā)展針對模板分子的新型檢測手段。MIPs在蛋白質(zhì)等生物大分子的分離分析過程中,通常需結(jié)合紫外-可見分光光度計(jì)、高效液相色譜或質(zhì)譜對MIPs吸附目標(biāo)物后的洗脫液進(jìn)行檢測。而模板分子的洗脫通常在較苛刻的條件下進(jìn)行,該過程易造成蛋白質(zhì)等生物大分子的變性、失活,難以實(shí)現(xiàn)對其有效檢測。因此,如何結(jié)合現(xiàn)代儀器分析,在無須對模板分子進(jìn)行洗脫的情況下實(shí)現(xiàn)對特定蛋白質(zhì)的有效檢測,將會是MIT發(fā)展的下一個重點(diǎn)。

(2)制備具有多識別位點(diǎn)的MIPs。傳統(tǒng)MIT以一種目標(biāo)物為模板分子,所得MIPs僅含有一種識別位點(diǎn),難以同時實(shí)現(xiàn)對兩種及兩種以上目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇性識別與檢測。雖有文獻(xiàn)報道,MIPs可用于多種化學(xué)小分子的同時選擇性識別與分離,但該策略在蛋白質(zhì)等生物大分子分離分析方面的報道不多。由于蛋白質(zhì)對環(huán)境條件要求苛刻,不同的蛋白質(zhì)的最佳印跡條件各不相同,因此對多種蛋白質(zhì)的同時、高效印跡困難重重。另外,可同時結(jié)合兩種及兩種以上蛋白質(zhì)的功能單體種類較少。因此,需不斷發(fā)展更加先進(jìn)的MIPs制備技術(shù)、探尋新型功能單體,以實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的同時、高效印跡。

(3)拓寬基于硼酸親和作用的MIPs的適用范圍。蛋白質(zhì)的糖基化與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),基于硼酸親和作用的MIPs憑借其對糖蛋白的高選擇性識別能力和靈活吸附、解離能力,成為目前分離分析糖蛋白的主流方法之一。然而基于硼酸親和作用的MIPs在酸性生物樣品,如pH值在4.5～7.0之間的血液、淚液、唾液和尿液等樣品中難以有效使用,嚴(yán)重限制了其在上述酸性生物樣品中應(yīng)用。因此急需開發(fā)酸性環(huán)境適用型的MIPs,不斷拓寬MIPs的適用范圍,以推動MIT在蛋白質(zhì)分離分析中的發(fā)展應(yīng)用。