薄文嘉，張寧，苗秀明，張良

(1.山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355； 2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 a.病理科， b.婦二科，濟南 250355)

隨著社會的不斷發(fā)展，不孕癥患者的發(fā)病率逐年升高，有報道指出在全球范圍內有8%～12%的育齡夫婦患有不孕或不育癥[1]。雖然全球不孕癥的平均患病率為9%，但在某些地區(qū)達到了30%[2]。隨著輔助生殖技術的迅速發(fā)展，許多不孕癥患者得到了診治，但臨床妊娠率仍需進一步提高，其中反復種植失敗(repeated implantation failure，RIF)是影響臨床妊娠結局的重要原因之一[3]。RIF是指不孕癥患者經歷多個體外受精(in vitro fertilization，IVF)或卵泡漿內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)周期并移植了多個胚胎而未發(fā)生胚胎著床或臨床妊娠[4]。早在2000年，Würfel[5]就研究了粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)對RIF患者的治療效果，結果表明使用G-CSF能顯著提高妊娠率。此后，專家們對RIF病例進行了大量類似研究，但結論不一致，有研究認為G-CSF可以改善子宮內膜厚度，提高種植率或臨床妊娠率，且不增加流產率[6-7]；亦有研究認為，G-CSF對臨床結果無明顯影響[8]。為進一步探究G-CSF對RIF患者的臨床療效，本研究采用Meta分析方法對G-CSF治療RIF患者的臨床效果進行綜合評價，以期為G-CSF的臨床應用提供更多參考依據。

1 資料與方法

1.1檢索策略 計算機檢索PubMed、Embase、the Cochrane Library、Web of Science、CBM及萬方、中國知網數據庫，并通過人工閱讀檢索參考文獻以及應用谷歌學術輔以檢索，避免文獻漏檢。文獻檢索采用主題詞和自由詞相結合的方法，中文檢索詞為(“反復種植失敗”或“反復移植失敗”或“反復著床失敗”)和“粒細胞集落刺激因子”和“隨機對照試驗”。英文檢索詞為("recurrent implantation failure" OR "repeated implantation failure") AND ("granulocyte colony-stimulating factor" OR "G-CSF") AND ("randomized controlled trial" OR "RCT")。檢索時間從各數據庫建庫至2020年3月31日。

1.2納入與排除標準

1.2.1納入標準 ①研究類型：均為隨機對照試驗。②研究對象：行IVF-胚胎移植或冷凍胚胎移植的反復著床失敗患者，其國籍、種族、病程不限；年齡≤40歲；無影響子宮內膜發(fā)育的先天性或系統性疾病。③干預措施：試驗組采用G-CSF治療；對照組未采用G-CSF治療。④結局指標：包括胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產率。

1.2.2排除標準 ①實驗動物的基礎研究；②重復發(fā)表的文獻、個案報道、綜述、學位論文及評述類論文；③數據不全或不能提供有效數據。

1.3文獻篩選與資料提取 由兩名評價員獨立進行文獻篩選和資料提取后核對,有異議之處通過雙方討論或交由第3名研究者判定結果。采用預先制訂的資料提取表提取資料，提取內容包括：①納入研究的基本信息，包括作者姓名、研究題目、發(fā)表年限等；②研究對象的基線特征，包括各組的例數及周期數、年齡、移植失敗次數等；③干預措施的具體細節(jié)；④偏倚風險評價的關鍵要素；⑤所關注的結局指標及數據。

1.4風險評價 納入研究的方法學質量采用Cochrane系統評價員手冊5.1.0 針對隨機對照試驗的偏倚風險評估工具進行評價，包括隨機分配方法、盲法等方面的偏倚風險。

1.5統計學方法 采用Cochrane協作網提供的RevMan 5.3軟件進行Meta分析。選用比值比(odds ratio，OR)作為效應尺度指標，采用95%置信區(qū)間 (confidence interval，CI)估計總體參數。各研究間的異質性采用I2檢驗評估。若I2<50%，異質性在可接受范圍內，選用固定效應模型合并分析；若I2>50%，則采用隨機效應模型分析。采用Funnel plot模型檢測發(fā)表偏倚，若兩邊對稱則無明顯發(fā)表偏倚，兩邊不對稱則可能存在發(fā)表偏倚。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1檢索結果 檢索獲得相關文獻365篇，經逐層篩選后，最終納入10個隨機對照試驗[5-14]，其中中文文獻1篇[14]、英文文獻9篇[5-13]，共1 012例RIF患者(試驗組511例、對照組501例)。文獻篩選流程及結果見圖1，入選的文獻基本特征見表1。

2.2質量評價 對納入分析的10篇隨機對照試驗文獻分別從序列產生、分配隱藏、盲法、不完全結局資料、選擇性結局報告和其他偏倚來源逐一進行低風險、不確定風險和高風險評價。在序列產生上，6篇文獻[6,8,11-14]為低風險，4篇文獻[5,7,9-10]存在不確定風險；在分配隱藏上，6篇文獻[6-11]為低風險，4篇文獻[5,12-14]存在不確定風險；在實施者和參與者的雙盲應用上，1篇文獻[11]為低風險，2篇文獻[6,13]為高風險，其余文獻[5,7-10,12，14]為不確定風險；在結局評估的盲法應用上，1篇[6]為高風險,其余為不確定風險[5,7-14]；在不完全結局資料上，1篇文獻[5]為低風險，其余9篇[6-14]為不確定風險；在選擇性結局報告上，2篇文獻[5,9]為低風險，其余8篇[6-8,10-14]為不確定風險；其他偏倚來源中，3篇[5-6,10]為低風險,其余7篇[7-9,11-14]為不確定風險。各研究的質量評價結果見圖2、3。

2.3Meta分析結果

2.3.1臨床妊娠率 納入的10個研究[5-14]均統計了臨床妊娠率,各研究間異質性差異無統計學意義(I2=0%，P=0.99)。采用固定效應模型分析顯示，試驗組的臨床妊娠率高于對照組(OR=2.87，95%CI2.15～3.82，P<0.000 01)，見圖4。

表1 納入文獻的基本特征

圖2 納入文獻的偏倚風險評估

圖3 納入文獻的偏倚風險條目評估

2.3.2胚胎種植率 納入的研究中有6個研究[6-7,11-14]描述了胚胎種植率,各研究間異質性差異無統計學意義(I2=0%，P=0.98)。采用固定效應模型分析顯示，試驗組的胚胎種植率高于對照組(OR=2.68，95%CI1.93～3.72，P<0.000 01)。見圖5。

2.3.3流產率 納入的研究中有2個研究[8,11]描述了流產率，各研究間異質性差異無統計學意義(I2=0%，P=0.79)。采用固定效應模型分析顯示，試驗組與對照組的流產率差異無統計學意義(OR=1.62，95%CI0.29～9.19，P=0.58)，見圖6。

2.4Meta分析亞組分析結果

2.4.1時間亞組 為探究不同時間使用G-CSF對臨床妊娠率的影響，本研究以移植日(移植日前使用G-CSF 6篇[6,8,11-14]，移植日或移植后開始使用4篇[5,7,9-10])為界進行了亞組分析，不論是移植日前還是移植日或者移植后使用，各研究間異質性差異無統計學意義(移植日前使用：I2=0%，P=0.95；移植日或移植日后使用：I2=0%，P=0.84)。采用固定效應模型分析顯示，試驗組的臨床妊娠率高于對照組(移植日前使用：OR=2.67，95%CI1.82～3.91，P<0.000 01；移植日或移植日后使用：OR=3.15，95%CI2.04～4.87，P<0.000 01)。見圖7。

2.4.2使用方式亞組 為了探究不同G-CSF使用方式對臨床妊娠率的影響，本研究進一步針對使用方式(皮下注射6篇[5-7,9-10,13]，宮腔灌注4篇[8,11-12,14])進行了亞組分析。兩個亞組的各納入研究間異質性差異無統計學意義(皮下注射：I2=0%，P=0.90；宮腔灌注：I2=0%，P=0.92)。采用固定效應模型分析顯示，試驗組的臨床妊娠率均顯著高于對照組(皮下注射：OR=3.03，95%CI2.10～4.36，P<0.000 01；宮腔灌注：OR=2.62，95%CI1.64～4.18，P<0.000 1)。見圖8。

2.5發(fā)表偏倚 在總體分析臨床妊娠率的研究中納入了10篇文獻[5-14]，其發(fā)表偏倚見圖9，漏斗圖不對稱，故存在一定發(fā)表偏倚，不排除納入文獻數量少、質量參差不齊的問題。

3 討 論

胚胎成功植入取決于胚胎的質量、子宮內膜的容受性和胚胎移植技術[15]。G-CSF是由骨髓細胞、

圖4 試驗組和對照組患者臨床妊娠率的Meta分析森林圖

圖5 試驗組和對照組患者胚胎種植率的Meta分析森林圖

圖6 試驗組和對照組患者流產率的Meta分析森林圖

圖7 時間亞組患者臨床妊娠率的Meta分析森林圖

圖8 不同使用方式亞組患者臨床妊娠率的Meta分析森林圖

基質細胞、成纖維細胞和巨噬細胞產生的特異性造血細胞因子，其會增加吞噬作用和氧化過程，而氧化吞噬作用是植入胚胎所必需的[16]，且內皮細胞、胎盤細胞、滋養(yǎng)細胞均含有G-CSF受體[17]。另外，G-CSF還可能影響對著床過程至關重要的子宮內膜基因的表達，如子宮內膜血管重構，局部免疫調節(jié)和細胞黏附機制[16]。體外胚泡形成和子宮內膜離體模型試驗顯示，G-CSF具有調節(jié)胚胎發(fā)育和子宮內膜血管重構的生理作用[18-19]。一項Meta分析顯示，將分子結構類似G-CSF的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子添加到IVF培養(yǎng)基中有益于胚胎發(fā)育，并提高優(yōu)胚率[20]?？梢?，G-CSF在調節(jié)子宮內膜容受性與改善胚胎質量方面發(fā)揮重要作用。

關于G-CSF的臨床效果有許多報道，Aleyasin等[6]的多中心隨機對照試驗指出，在移植前使用單次劑量皮下注射G-CSF，可以明顯提高RIF患者的胚胎種植率和臨床妊娠率。Scarpellini和Sbracia[9]對109例RIF患者進行研究，每日使用G-CSF 60 mg治療，并在妊娠試驗陽性后繼續(xù)接受40 d的治療，結果顯示G-CSF組的臨床妊娠率為43.1%，而安慰劑組(0.9% NaCl注射液注射)為21.6%，且沒有不良反應的報道。而Kunicki等[21]的研究表明，G-CSF可改善子宮內膜厚度，但不會提高臨床妊娠率和活產率。雖然G-CSF在改善RIF臨床結局中具有一定作用，但目前研究仍較少，且開展時間較短，尚未形成一套完善的臨床治療標準，包括其使用方式、給藥劑量及用藥時間均未有統一標準。Zeyneloglu等[22]首次對RIF患者使用G-GSF的方式進行了研究，將111例RIF患者分為3組，A組使用皮下注射，B組宮腔灌注與皮下注射相結合，C組為空白對照。結果顯示，與皮下注射與空白對照相比，宮腔灌注聯合皮下注射能顯著提高RIF患者的臨床妊娠率與活產率。 而Xie等[23]認為，只有通過宮腔灌注才能改善輔助生殖技術的妊娠結局。

本研究Meta分析結果顯示，與未采用G-CSF治療相比，采用G-CSF治療能顯著提高胚胎移植后的種植率及臨床妊娠率，且不增加流產的發(fā)生，說明G-CSF能提高RIF患者的治療效果。這與Zhang等[24]關于G-CSF對IVF-胚胎移植臨床結局影響的Meta分析結果相一致。本研究對使用時間和使用方式的亞組分析顯示，移植日或移植日后使用優(yōu)于移植前使用，皮下注射優(yōu)于宮腔灌注。本研究的局限性為：①各研究G-CSF使用劑量、使用療程等存在差異,導致研究對象的臨床異質性，可能影響Meta分析結果的可靠性；②本研究開展時間尚短，搜索到的文獻數量有限且樣本量較小，期待設計嚴謹、高質量、大樣本的相關研究，以更深一步地分析與驗證，為臨床工作提供更加堅實可靠的證據。

綜上所述，與未采用G-CSF治療相比，采用G-CSF治療的RIF患者具有更高的臨床妊娠率與胚胎種植率，且不會增加流產率，移植日或移植后應用優(yōu)于移植日前應用，皮下注射優(yōu)于宮腔灌注。