薄文嘉，張寧，苗秀明，張良

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 a.病理科， b.婦二科，濟(jì)南 250355)

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，不孕癥患者的發(fā)病率逐年升高，有報(bào)道指出在全球范圍內(nèi)有8%～12%的育齡夫婦患有不孕或不育癥[1]。雖然全球不孕癥的平均患病率為9%，但在某些地區(qū)達(dá)到了30%[2]。隨著輔助生殖技術(shù)的迅速發(fā)展，許多不孕癥患者得到了診治，但臨床妊娠率仍需進(jìn)一步提高，其中反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure，RIF)是影響臨床妊娠結(jié)局的重要原因之一[3]。RIF是指不孕癥患者經(jīng)歷多個(gè)體外受精(in vitro fertilization，IVF)或卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)周期并移植了多個(gè)胚胎而未發(fā)生胚胎著床或臨床妊娠[4]。早在2000年，Würfel[5]就研究了粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)對(duì)RIF患者的治療效果，結(jié)果表明使用G-CSF能顯著提高妊娠率。此后，專家們對(duì)RIF病例進(jìn)行了大量類似研究，但結(jié)論不一致，有研究認(rèn)為G-CSF可以改善子宮內(nèi)膜厚度，提高種植率或臨床妊娠率，且不增加流產(chǎn)率[6-7]；亦有研究認(rèn)為，G-CSF對(duì)臨床結(jié)果無明顯影響[8]。為進(jìn)一步探究G-CSF對(duì)RIF患者的臨床療效，本研究采用Meta分析方法對(duì)G-CSF治療RIF患者的臨床效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為G-CSF的臨床應(yīng)用提供更多參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1檢索策略 計(jì)算機(jī)檢索PubMed、Embase、the Cochrane Library、Web of Science、CBM及萬方、中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)，并通過人工閱讀檢索參考文獻(xiàn)以及應(yīng)用谷歌學(xué)術(shù)輔以檢索，避免文獻(xiàn)漏檢。文獻(xiàn)檢索采用主題詞和自由詞相結(jié)合的方法，中文檢索詞為(“反復(fù)種植失敗”或“反復(fù)移植失敗”或“反復(fù)著床失敗”)和“粒細(xì)胞集落刺激因子”和“隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)”。英文檢索詞為("recurrent implantation failure" OR "repeated implantation failure") AND ("granulocyte colony-stimulating factor" OR "G-CSF") AND ("randomized controlled trial" OR "RCT")。檢索時(shí)間從各數(shù)據(jù)庫(kù)建庫(kù)至2020年3月31日。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn) ①研究類型：均為隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)。②研究對(duì)象：行IVF-胚胎移植或冷凍胚胎移植的反復(fù)著床失敗患者，其國(guó)籍、種族、病程不限；年齡≤40歲；無影響子宮內(nèi)膜發(fā)育的先天性或系統(tǒng)性疾病。③干預(yù)措施：試驗(yàn)組采用G-CSF治療；對(duì)照組未采用G-CSF治療。④結(jié)局指標(biāo)：包括胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn) ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基礎(chǔ)研究；②重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)、個(gè)案報(bào)道、綜述、學(xué)位論文及評(píng)述類論文；③數(shù)據(jù)不全或不能提供有效數(shù)據(jù)。

1.3文獻(xiàn)篩選與資料提取 由兩名評(píng)價(jià)員獨(dú)立進(jìn)行文獻(xiàn)篩選和資料提取后核對(duì),有異議之處通過雙方討論或交由第3名研究者判定結(jié)果。采用預(yù)先制訂的資料提取表提取資料，提取內(nèi)容包括：①納入研究的基本信息，包括作者姓名、研究題目、發(fā)表年限等；②研究對(duì)象的基線特征，包括各組的例數(shù)及周期數(shù)、年齡、移植失敗次數(shù)等；③干預(yù)措施的具體細(xì)節(jié)；④偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的關(guān)鍵要素；⑤所關(guān)注的結(jié)局指標(biāo)及數(shù)據(jù)。

1.4風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià) 納入研究的方法學(xué)質(zhì)量采用Cochrane系統(tǒng)評(píng)價(jià)員手冊(cè)5.1.0 針對(duì)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括隨機(jī)分配方法、盲法等方面的偏倚風(fēng)險(xiǎn)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Cochrane協(xié)作網(wǎng)提供的RevMan 5.3軟件進(jìn)行Meta分析。選用比值比(odds ratio，OR)作為效應(yīng)尺度指標(biāo)，采用95%置信區(qū)間 (confidence interval，CI)估計(jì)總體參數(shù)。各研究間的異質(zhì)性采用I2檢驗(yàn)評(píng)估。若I2<50%，異質(zhì)性在可接受范圍內(nèi)，選用固定效應(yīng)模型合并分析；若I2>50%，則采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析。采用Funnel plot模型檢測(cè)發(fā)表偏倚，若兩邊對(duì)稱則無明顯發(fā)表偏倚，兩邊不對(duì)稱則可能存在發(fā)表偏倚。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1檢索結(jié)果 檢索獲得相關(guān)文獻(xiàn)365篇，經(jīng)逐層篩選后，最終納入10個(gè)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)[5-14]，其中中文文獻(xiàn)1篇[14]、英文文獻(xiàn)9篇[5-13]，共1 012例RIF患者(試驗(yàn)組511例、對(duì)照組501例)。文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果見圖1，入選的文獻(xiàn)基本特征見表1。

2.2質(zhì)量評(píng)價(jià) 對(duì)納入分析的10篇隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)文獻(xiàn)分別從序列產(chǎn)生、分配隱藏、盲法、不完全結(jié)局資料、選擇性結(jié)局報(bào)告和其他偏倚來源逐一進(jìn)行低風(fēng)險(xiǎn)、不確定風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。在序列產(chǎn)生上，6篇文獻(xiàn)[6,8,11-14]為低風(fēng)險(xiǎn)，4篇文獻(xiàn)[5,7,9-10]存在不確定風(fēng)險(xiǎn)；在分配隱藏上，6篇文獻(xiàn)[6-11]為低風(fēng)險(xiǎn)，4篇文獻(xiàn)[5,12-14]存在不確定風(fēng)險(xiǎn)；在實(shí)施者和參與者的雙盲應(yīng)用上，1篇文獻(xiàn)[11]為低風(fēng)險(xiǎn)，2篇文獻(xiàn)[6,13]為高風(fēng)險(xiǎn)，其余文獻(xiàn)[5,7-10,12，14]為不確定風(fēng)險(xiǎn)；在結(jié)局評(píng)估的盲法應(yīng)用上，1篇[6]為高風(fēng)險(xiǎn),其余為不確定風(fēng)險(xiǎn)[5,7-14]；在不完全結(jié)局資料上，1篇文獻(xiàn)[5]為低風(fēng)險(xiǎn)，其余9篇[6-14]為不確定風(fēng)險(xiǎn)；在選擇性結(jié)局報(bào)告上，2篇文獻(xiàn)[5,9]為低風(fēng)險(xiǎn)，其余8篇[6-8,10-14]為不確定風(fēng)險(xiǎn)；其他偏倚來源中，3篇[5-6,10]為低風(fēng)險(xiǎn),其余7篇[7-9,11-14]為不確定風(fēng)險(xiǎn)。各研究的質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果見圖2、3。

2.3Meta分析結(jié)果

2.3.1臨床妊娠率 納入的10個(gè)研究[5-14]均統(tǒng)計(jì)了臨床妊娠率,各研究間異質(zhì)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(I2=0%，P=0.99)。采用固定效應(yīng)模型分析顯示，試驗(yàn)組的臨床妊娠率高于對(duì)照組(OR=2.87，95%CI2.15～3.82，P<0.000 01)，見圖4。

表1 納入文獻(xiàn)的基本特征

圖2 納入文獻(xiàn)的偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

圖3 納入文獻(xiàn)的偏倚風(fēng)險(xiǎn)條目評(píng)估

2.3.2胚胎種植率 納入的研究中有6個(gè)研究[6-7,11-14]描述了胚胎種植率,各研究間異質(zhì)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(I2=0%，P=0.98)。采用固定效應(yīng)模型分析顯示，試驗(yàn)組的胚胎種植率高于對(duì)照組(OR=2.68，95%CI1.93～3.72，P<0.000 01)。見圖5。

2.3.3流產(chǎn)率 納入的研究中有2個(gè)研究[8,11]描述了流產(chǎn)率，各研究間異質(zhì)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(I2=0%，P=0.79)。采用固定效應(yīng)模型分析顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組的流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.62，95%CI0.29～9.19，P=0.58)，見圖6。

2.4Meta分析亞組分析結(jié)果

2.4.1時(shí)間亞組 為探究不同時(shí)間使用G-CSF對(duì)臨床妊娠率的影響，本研究以移植日(移植日前使用G-CSF 6篇[6,8,11-14]，移植日或移植后開始使用4篇[5,7,9-10])為界進(jìn)行了亞組分析，不論是移植日前還是移植日或者移植后使用，各研究間異質(zhì)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(移植日前使用：I2=0%，P=0.95；移植日或移植日后使用：I2=0%，P=0.84)。采用固定效應(yīng)模型分析顯示，試驗(yàn)組的臨床妊娠率高于對(duì)照組(移植日前使用：OR=2.67，95%CI1.82～3.91，P<0.000 01；移植日或移植日后使用：OR=3.15，95%CI2.04～4.87，P<0.000 01)。見圖7。

2.4.2使用方式亞組 為了探究不同G-CSF使用方式對(duì)臨床妊娠率的影響，本研究進(jìn)一步針對(duì)使用方式(皮下注射6篇[5-7,9-10,13]，宮腔灌注4篇[8,11-12,14])進(jìn)行了亞組分析。兩個(gè)亞組的各納入研究間異質(zhì)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(皮下注射：I2=0%，P=0.90；宮腔灌注：I2=0%，P=0.92)。采用固定效應(yīng)模型分析顯示，試驗(yàn)組的臨床妊娠率均顯著高于對(duì)照組(皮下注射：OR=3.03，95%CI2.10～4.36，P<0.000 01；宮腔灌注：OR=2.62，95%CI1.64～4.18，P<0.000 1)。見圖8。

2.5發(fā)表偏倚 在總體分析臨床妊娠率的研究中納入了10篇文獻(xiàn)[5-14]，其發(fā)表偏倚見圖9，漏斗圖不對(duì)稱，故存在一定發(fā)表偏倚，不排除納入文獻(xiàn)數(shù)量少、質(zhì)量參差不齊的問題。

3 討 論

胚胎成功植入取決于胚胎的質(zhì)量、子宮內(nèi)膜的容受性和胚胎移植技術(shù)[15]。G-CSF是由骨髓細(xì)胞、

圖4 試驗(yàn)組和對(duì)照組患者臨床妊娠率的Meta分析森林圖

圖5 試驗(yàn)組和對(duì)照組患者胚胎種植率的Meta分析森林圖

圖6 試驗(yàn)組和對(duì)照組患者流產(chǎn)率的Meta分析森林圖

圖7 時(shí)間亞組患者臨床妊娠率的Meta分析森林圖

圖8 不同使用方式亞組患者臨床妊娠率的Meta分析森林圖

基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的特異性造血細(xì)胞因子，其會(huì)增加吞噬作用和氧化過程，而氧化吞噬作用是植入胚胎所必需的[16]，且內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞均含有G-CSF受體[17]。另外，G-CSF還可能影響對(duì)著床過程至關(guān)重要的子宮內(nèi)膜基因的表達(dá)，如子宮內(nèi)膜血管重構(gòu)，局部免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞黏附機(jī)制[16]。體外胚泡形成和子宮內(nèi)膜離體模型試驗(yàn)顯示，G-CSF具有調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和子宮內(nèi)膜血管重構(gòu)的生理作用[18-19]。一項(xiàng)Meta分析顯示，將分子結(jié)構(gòu)類似G-CSF的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子添加到IVF培養(yǎng)基中有益于胚胎發(fā)育，并提高優(yōu)胚率[20]?？梢?，G-CSF在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性與改善胚胎質(zhì)量方面發(fā)揮重要作用。

關(guān)于G-CSF的臨床效果有許多報(bào)道，Aleyasin等[6]的多中心隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)指出，在移植前使用單次劑量皮下注射G-CSF，可以明顯提高RIF患者的胚胎種植率和臨床妊娠率。Scarpellini和Sbracia[9]對(duì)109例RIF患者進(jìn)行研究，每日使用G-CSF 60 mg治療，并在妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性后繼續(xù)接受40 d的治療，結(jié)果顯示G-CSF組的臨床妊娠率為43.1%，而安慰劑組(0.9% NaCl注射液注射)為21.6%，且沒有不良反應(yīng)的報(bào)道。而Kunicki等[21]的研究表明，G-CSF可改善子宮內(nèi)膜厚度，但不會(huì)提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率。雖然G-CSF在改善RIF臨床結(jié)局中具有一定作用，但目前研究仍較少，且開展時(shí)間較短，尚未形成一套完善的臨床治療標(biāo)準(zhǔn)，包括其使用方式、給藥劑量及用藥時(shí)間均未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。Zeyneloglu等[22]首次對(duì)RIF患者使用G-GSF的方式進(jìn)行了研究，將111例RIF患者分為3組，A組使用皮下注射，B組宮腔灌注與皮下注射相結(jié)合，C組為空白對(duì)照。結(jié)果顯示，與皮下注射與空白對(duì)照相比，宮腔灌注聯(lián)合皮下注射能顯著提高RIF患者的臨床妊娠率與活產(chǎn)率。 而Xie等[23]認(rèn)為，只有通過宮腔灌注才能改善輔助生殖技術(shù)的妊娠結(jié)局。

本研究Meta分析結(jié)果顯示，與未采用G-CSF治療相比，采用G-CSF治療能顯著提高胚胎移植后的種植率及臨床妊娠率，且不增加流產(chǎn)的發(fā)生，說明G-CSF能提高RIF患者的治療效果。這與Zhang等[24]關(guān)于G-CSF對(duì)IVF-胚胎移植臨床結(jié)局影響的Meta分析結(jié)果相一致。本研究對(duì)使用時(shí)間和使用方式的亞組分析顯示，移植日或移植日后使用優(yōu)于移植前使用，皮下注射優(yōu)于宮腔灌注。本研究的局限性為：①各研究G-CSF使用劑量、使用療程等存在差異,導(dǎo)致研究對(duì)象的臨床異質(zhì)性，可能影響Meta分析結(jié)果的可靠性；②本研究開展時(shí)間尚短，搜索到的文獻(xiàn)數(shù)量有限且樣本量較小，期待設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)、高質(zhì)量、大樣本的相關(guān)研究，以更深一步地分析與驗(yàn)證，為臨床工作提供更加堅(jiān)實(shí)可靠的證據(jù)。

綜上所述，與未采用G-CSF治療相比，采用G-CSF治療的RIF患者具有更高的臨床妊娠率與胚胎種植率，且不會(huì)增加流產(chǎn)率，移植日或移植后應(yīng)用優(yōu)于移植日前應(yīng)用，皮下注射優(yōu)于宮腔灌注。