吳莉莉，白術(shù)杰，王書(shū)紅，張羽男

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院， 黑龍江 佳木斯 154007)

細(xì)葉小檗(Berberis poiretii Schneid)是小檗科小檗屬的植物。別名三顆針、針雀，分布于俄羅斯、朝鮮、蒙古以及中國(guó)大陸的黑龍江、吉林、山西等地，生長(zhǎng)于海拔600～2,300米的地區(qū)，目前尚未由人工引種栽培。根、根皮中含有多種生物堿，主要為小檗堿，功效是清熱燥濕、瀉火解毒、健胃。用治療吐瀉、痢疾、咳嗽、膽囊炎、目赤、口瘡、無(wú)名腫毒、濕疹、燒、燙傷、高血壓癥。但細(xì)葉小檗葉的總黃酮含量測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道?，F(xiàn)對(duì)東北地區(qū)的細(xì)葉小檗葉的總黃酮進(jìn)行提取及含量測(cè)定，為細(xì)葉小檗葉資源的合理開(kāi)發(fā)和利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

樣品采自黑龍江省伊春市嘉蔭縣山區(qū)，由佳木斯大學(xué)藥學(xué)院宗希明老師鑒定為細(xì)葉小檗葉。

1.2 儀器與試劑

UV-757CRT型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[1](上海精科學(xué)儀器有限公司)，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，UV-1型三用紫外分析儀(上海市安亭電子儀器廠)，KQ 5200型超聲波清洗器(江蘇昆山儀器廠)，101-Ⅲ型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(江蘇大地自動(dòng)化儀器廠)，98-1-B 型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為中國(guó)藥品生物制品鑒定所購(gòu)買，所用硅膠G為青島海洋化工集團(tuán)公司生產(chǎn)，氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、三氯化鋁、鎂粉、甲醇、95%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、冰醋酸、正丁醇、鹽酸、濃硫酸等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃酮檢識(shí)試驗(yàn)

在進(jìn)行含量測(cè)定之前，對(duì)細(xì)葉小檗葉采用試管試驗(yàn)、紙色譜、薄層色譜進(jìn)行了鹽酸鎂粉反應(yīng)、三氯化鋁反應(yīng)、乙酸鎂反應(yīng)等黃酮檢識(shí)試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 樣品的黃酮檢識(shí)反應(yīng)結(jié)果

細(xì)葉小檗葉提取液的黃酮檢測(cè)結(jié)果均為正反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該植物中含有黃酮類化合物。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

精密稱取 120 ℃干燥至恒重的蘆丁[2]對(duì)照品19.03mg，置于50mL容量瓶中，用甲醇完全溶解并定容，蘆丁對(duì)照品濃度為，分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL(標(biāo)號(hào)為標(biāo)1～7)的容量瓶中，以甲醇為溶劑，亞硝酸鈉、硝酸鋁[3]和氫氧化鈉為顯示劑，分別以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)(λ)為橫坐標(biāo)作圖，得到吸收曲線，細(xì)葉小檗葉和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸收曲線 ，均在510nm處有一強(qiáng)吸收最大吸收波，因此選擇510nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將已制備好的7個(gè)蘆丁對(duì)照品溶液置于紫外分光光度計(jì)中，在200～800nm(間隔1nm)下全波長(zhǎng)掃描[4]，樣品檢測(cè)波長(zhǎng)在510nm處分別測(cè)定吸光度；以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度 C 為橫坐標(biāo)，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示蘆丁濃度在0.0156～0.0468mg/mL間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為C=0.0471A-0.0128，r=0.9988，得到蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 提取工藝研究

取干燥細(xì)葉小檗葉粗粉60g平均分成2份，分別用10倍量的65%的乙醇[5]和95%的乙醇[6]浸泡1h超聲(功率 250 W ，頻率40kHz)提取法[7]提取2次，時(shí)間30min，溫度60℃合并提取液，過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮為2份墨綠色浸膏。分別將浸膏加水體積比1：1.5分散后分別用石油醚、氯仿、乙酸乙脂、正丁醇進(jìn)行梯度萃取。棄去石油醚萃取液，其它萃取液分別回收溶劑后合并后得2份提取物分別加甲醇 50mL溶解過(guò)濾過(guò)濾至 100mL容量瓶中，殘?jiān)腿萜饔蒙倭考状级啻蜗礈?，洗液加入容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度[8]，搖勻。65%的乙醇提取物為檢液Ⅰ、95%的乙醇提取物為檢液Ⅱ。取干燥細(xì)葉小檗葉粗粉約10g分成2份分別包入濾紙中置2個(gè)索氏提取器中水浴回流提取，各加石油醚180mL,回流 2h，棄去石油醚液，分別加65%乙醇，95%乙醇150mL,水浴回流提取2h，回收溶劑后加甲醇定容于100mL容量瓶中65%乙醇提取物為檢液III、95%乙醇為檢液IV。

精密量取檢液Ⅰ、檢液Ⅱ、檢液III、檢液IV各2mL，分別置25mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下先加5%亞硝酸鈉1.0mL，6min后加10%硝酸鋁1.0mL，6min后加4%氫氧化鈉10mL，加甲醇至刻度搖勻后室溫放置15min后，依次測(cè)定吸光度，計(jì)算出細(xì)葉小檗葉總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

式中x：總黃酮含量，%；

C1：檢測(cè)液中總黃酮濃度，mg/mL；

V1：檢測(cè)液處理后的體積，mL；

V： 配制的檢測(cè)液總體積，mL；

V2：樣品中檢測(cè)液的體積，mL；

W：小檗葉樣品干重，mg。

表2 細(xì)葉小檗葉的總黃酮含量檢測(cè)

2.5 結(jié)果

根據(jù)表2分析數(shù)據(jù)得出以下結(jié)論：檢液Ⅰ總黃酮含量 0.513%、檢液Ⅱ?yàn)?0.291%、檢液III為0.498%、檢液IV為0.288%。細(xì)葉小檗葉在提取溶劑為 65% 乙醇，超聲功率為 462W，超聲時(shí)間為30min，超聲溫度為60℃的超聲條件下總黃酮提取率最高。

3 討論

取干燥細(xì)葉小檗葉粗粉進(jìn)行活性成分的提取、并做了黃酮檢識(shí)試驗(yàn)，結(jié)果均為正反應(yīng)，證明細(xì)葉小檗葉中含有黃酮成分。分別取不同濃度乙醇為溶劑采用超聲波及連續(xù)回流提取法分別對(duì)細(xì)葉小檗葉中總黃酮成分進(jìn)行提取，采用比色法對(duì)檢液Ⅰ、Ⅱ、III、IV依次進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定。結(jié)果顯示不同溶劑和不同提取方法得到總黃酮含量也有差別。檢測(cè)結(jié)果分別為0.513%、0.291%、0.498%、0.288%。因此以65% 乙醇為溶劑，超聲波提取方法，適用細(xì)葉小檗葉中總黃酮含量測(cè)定。為合理開(kāi)發(fā)細(xì)葉小檗葉提供試驗(yàn)依據(jù)，細(xì)葉小檗葉可以成為黃酮新藥資源。