王倩倩，盧均坤，王燕琴

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007；2.湛江市第一中醫(yī)院，廣東 湛江 524043；3.佳木斯大學(xué)校醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154007)

阿霉素是臨床應(yīng)用廣泛的化療藥物，在臨床中被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的治療，但因其劑量依賴性的心肌損傷而限制了臨床應(yīng)用，阿霉素通過氧化應(yīng)激、DNA損傷、心肌纖維化、細(xì)胞凋亡等導(dǎo)致心肌損傷[1～3]。蒽環(huán)類藥物引起的心臟毒性可以分成急性、慢性和遲發(fā)性心臟毒性，多數(shù)患者在蒽環(huán)類藥物給藥后可較快地發(fā)生心肌損傷，且隨著時間的延長愈加明顯[4]。在給予蒽環(huán)類藥物的數(shù)年后，超過50% 的患者可發(fā)生左心室組織和功能亞臨床心臟超聲變化，并且蒽環(huán)類藥物沒有絕對的“安全劑量”[5]。

研究顯示線粒體呼吸鏈復(fù)合物I不僅產(chǎn)生ATP，而且在細(xì)胞凋亡中起重要作用。叢生蛋白(CLU)的過表達(dá)減輕了六價鉻[Cr(VI)]誘導(dǎo)的線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ抑制、ROS積累、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放和線粒體膜電位(MMP)塌陷，CLU誘導(dǎo)的線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性增加對Cr(VI)誘導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用[6]。研究表明，DOX誘導(dǎo)MMP耗竭和MPTP開放，從而導(dǎo)致能量穩(wěn)態(tài)紊亂，線粒體腫脹，外膜破裂，并促凋亡介質(zhì)釋放[7]。

苦參堿是中國傳統(tǒng)的中藥，苦參堿及其衍生物有廣泛的藥理作用，被廣泛應(yīng)用在抗肝炎、抗肝纖維化[8]，治療癌癥[9]、抗病毒[10]，治療心血管疾病等[11]，苦參堿能夠減輕放射性損傷的器官損傷[12]?？鄥A能夠顯著減輕心力衰竭患者心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)、降低谷草轉(zhuǎn)氨酶水平、乳酸脫氫酶水平、顯著提高心力衰竭大鼠的射血分?jǐn)?shù)，減輕心肌細(xì)胞凋亡[13]。既往研究中我們發(fā)現(xiàn)150mg/L苦參堿對阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡具有顯著的保護(hù)作用[14]。因此本實(shí)驗繼續(xù)通過制備阿霉素致H9c2心肌細(xì)胞損傷的體外模型，給與苦參堿預(yù)處理，研究苦參堿在阿霉素致H9c2心肌細(xì)胞損傷中的凋亡、線粒體膜電位及線粒體呼吸鏈復(fù)合物I的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞

H9c2細(xì)胞系是大鼠心肌細(xì)胞系(購買自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所)，H9c2心肌細(xì)胞的正常生長條件是：37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁生長。

1.2 藥品和試劑

注射用苦參堿(山東瑞陽藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.15g/支)，注射用阿霉素(浙江海正藥業(yè)有限公司，規(guī)格10mg/支)，Hoechst染色試劑盒，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)均購自碧云天生物技術(shù)公司。線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

H9c2心肌細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%時，棄培養(yǎng)基，2～5mL PBS液沖洗兩遍，加0.25%胰蛋白酶700μL，消化30s后，細(xì)胞開始脫離瓶壁時，加入5mL培養(yǎng)基終止消化，按適當(dāng)比例分到新的培養(yǎng)瓶中，按照細(xì)胞培養(yǎng)方法繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至2～3代細(xì)胞進(jìn)行分組試驗。

2.2 細(xì)胞生存率檢測

如2.1進(jìn)行分組加藥處理，每組設(shè)6個復(fù)孔，作用24h后，抽出培養(yǎng)液，PBS洗滌一次，將2mL MTT溶劑加入20mL完全培養(yǎng)液中，充分混勻，每孔加200μL，放入培養(yǎng)箱孵育4h 后抽出，每孔加150μL DMSO。酶標(biāo)儀測各孔480nm波長處的光密度(OD)。MTT法檢測單獨(dú)阿霉素、單獨(dú)苦參堿、苦參堿+阿霉素、空白對照組的細(xì)胞生存率，繪制生存率曲線，并進(jìn)一步確定苦參堿的濃度范圍，細(xì)胞生存率=給藥組OD/空白對照組OD×100%。

2.3 分組設(shè)置及給藥方式

空白對照組：接受生理鹽水作為干預(yù)因素；阿霉素組：接受濃度1.0mg/L阿霉素作為損傷模型；阿霉素+苦參堿組：給與濃度150mg/L的苦參堿3h后再接受濃度1.0mg/L阿霉素；苦參堿組：接受濃度150mg/L苦參堿作為干預(yù)因素，放至37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，進(jìn)行下一步試驗。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測

取無菌蓋玻片置于六孔板中，將H9c2心肌細(xì)胞接種于六孔板中,調(diào)細(xì)胞濃度為1.1×105個/mL，每孔3mL，培養(yǎng)過夜，如2.3進(jìn)行分組加藥處理，作用24h后，吸去舊培養(yǎng)液，按照細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白。

2.5 線粒體膜電位檢測

按照線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)說明書進(jìn)行染色。激光共聚焦顯微鏡下觀察。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光，線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。

2.6 線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ檢測

按照線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ說明書進(jìn)行操作。復(fù)合物Ⅰ(EC1.6.5.3)又稱NADH-CoQ還原酶或NADH脫氫酶的主要元素，復(fù)合物I催化NADH氧化。廣泛存在于動物、植物、 微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中最大的蛋白復(fù)合物。該酶催化一對電子從 NADH 傳遞給CoQ，同時可使O2還原生成O2-，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生 O2-的主要部位。測定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈(ETC)狀態(tài)，而且可以反映活性氧(ROS)生成狀態(tài)。線粒體復(fù)合物Ⅰ能夠催化NADH 脫氫生成 NAD+，在酶標(biāo)儀340nm波長下測定NADH 的氧化速率計算出該酶活性的大小。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞生存率

細(xì)胞生存率是在96孔板培養(yǎng)24h，觀察細(xì)胞生長及死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對照組H9c2心肌細(xì)胞生長良好，貼壁良好，極少有漂浮死亡細(xì)胞(定義為100%)。阿霉素組漂浮死亡細(xì)胞較多，同空白對照組有顯著差異(P<0.05)。H9c2心肌細(xì)胞生存率在阿霉素+苦參堿組同單純阿霉素組比較有顯著差異(P< 0.05)，單純苦參堿組的細(xì)胞生長情況良好細(xì)胞增值略有增加，同空白對照組比較差異無顯著性(P>0.05)，見表1。

表1 不同組別H9c2心肌細(xì)胞生存率

3.2 細(xì)胞凋亡

分別比較不同藥物作用于H9c2心肌細(xì)胞24h后，與空白對照組比較，阿霉素組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，與阿霉素組比較苦參堿+阿霉素組，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。見圖1，表2。

空白對照組 阿霉素組(1mg/L) 苦參堿(150mg/L)+阿霉素組(1mg/L)圖1 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡染色(×20)

表2 不同組別H9c2心肌細(xì)胞凋亡率

3.3 線粒體JC-1膜電位

分別比較不同藥物作用于H9c2心肌細(xì)胞24h線粒體膜電位，與阿霉素組比較，苦參堿+阿霉素組細(xì)胞綠色熒光明顯減少(P<0.05)、紅色熒光顯著增加(P<0.05)，與空白對照組比較，阿霉素組心肌細(xì)胞綠色熒光顯著增多(P<0.05)甚至接近陽性質(zhì)控指標(biāo)，說明阿霉素對線粒體膜電位損害嚴(yán)重，各組紅色熒光/綠色熒光比率，見圖2及表3。

圖2 不同組別H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位激光共聚焦JC-1染色(×40)

表3 不同組別H9c2心肌細(xì)胞線粒體激光共聚焦JC-1染色情況

3.4 線粒體呼吸鏈復(fù)合物

與空白對照組比較，阿霉素組H9c2細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與阿霉素組比較，苦參堿+阿霉素組心肌細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同組別H9c2心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性檢測

4 討論

惡性腫瘤是世界范圍內(nèi)公共健康問題，隨著年齡增長，發(fā)病率也隨之上升，治療惡性腫瘤常用的化療藥物如蒽環(huán)類藥物，通常與心臟毒性相關(guān)，阿霉素(蒽環(huán)類藥物)可以引起遠(yuǎn)期心力衰竭[15]。一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)，在使用阿霉素累積量達(dá)到400、500、和550mg/m2，心力衰竭發(fā)生率分別達(dá)到5%、16%、26%[16]。盡管阿霉素具有心臟毒性作用，但臨床中因為沒有更好的替代藥物，還是被廣泛的應(yīng)用。因此，發(fā)現(xiàn)能夠降低阿霉素的心臟毒性作用，并且不影響阿霉素的治療功能，是我們迫切的任務(wù)。阿霉素能特異性與線粒體內(nèi)膜豐富的心磷脂結(jié)合，導(dǎo)致線粒內(nèi)阿霉素聚集，抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I和II的活性，破壞電子聯(lián)傳遞，進(jìn)一步促進(jìn)ROS產(chǎn)生[17]。

在本實(shí)驗中，我們通過MTT法檢測給與阿霉素后H9c2心肌細(xì)胞的生存率發(fā)現(xiàn)，阿霉素可以導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞生存率大幅度下降。在單純苦參堿共孵育H9c2心肌細(xì)胞時，心肌細(xì)胞數(shù)量較空白對照組略有增加，這可能是苦參堿促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的結(jié)果。在苦參堿預(yù)處理后再給與阿霉素顯著提高H9c2心肌細(xì)胞生存率。由此，我們得出結(jié)論，苦參堿預(yù)處理，能抑制阿霉素對心肌細(xì)胞的傷害。

本實(shí)驗利用細(xì)胞凋亡-Hoechst染色法觀察H9c2心肌細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠顯著降低阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡，苦參堿的藥理作用廣泛，臨床應(yīng)用較多，有研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能顯著減輕缺血性腦卒中小鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡及形態(tài)學(xué)的損傷，顯著降低丙二醛(MDA)的水平，提高超氧化物歧化(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性[18]。在心力衰竭方面有研究發(fā)現(xiàn)[19]，苦參堿能夠改善心力衰竭大鼠的左室射血分?jǐn)?shù)、減輕心肌細(xì)胞凋亡、抑制心肌纖維化。也有研究表明，苦參堿能夠減輕左心房心肌纖維化，降低 I、III型膠原蛋白水平，預(yù)防心肌梗死后心房纖顫的發(fā)生[20]。這些研究，也表明苦參堿在保護(hù)阿霉素引起的心肌損傷中，具有重要的理論依據(jù)。

氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的三羧酸循環(huán)在ATP酶作用下產(chǎn)生ATP，儲存于線粒體內(nèi)膜，這些轉(zhuǎn)換不僅形成質(zhì)子梯度，還形成氫離子的跨膜電勢，產(chǎn)生MMP。在正常情況下，維持細(xì)胞內(nèi)的ATP水平和穩(wěn)定的MMP，對于維持細(xì)胞正常生理功能至關(guān)重要[21]。阿霉素可以使MMP大幅下降，當(dāng)線粒體功能障礙時MMP下降，伴隨著ROS產(chǎn)生增加、損害ATP的生成，這些在阿霉素引起的中毒性心肌病中尤為重要[22]。在本實(shí)驗中我們發(fā)現(xiàn)，阿霉素可以使線粒體膜電位顯著降低，說明線粒體通透性(mitochondria permeability transition，MPT)顯著增加，苦參堿顯著改善阿霉素引起的MMP下降。

我們的實(shí)驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，H9c2心肌細(xì)胞在阿霉素的作用下，線粒體呼吸鏈復(fù)合體物I的活性顯著降低，而苦參堿能顯著提高因阿霉素?fù)p害的心肌細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體物I活性。線粒體呼吸鏈復(fù)合體物I是線粒體呼吸鏈中第一個也是最大的復(fù)合體，線粒體F1F0-ATP合酶利用電子傳遞鏈上的線粒體呼吸鏈復(fù)合體物I、線粒體呼吸鏈復(fù)合體物III、線粒體呼吸鏈復(fù)合體物IV所產(chǎn)生的質(zhì)子梯度，線粒體呼吸鏈上發(fā)生的氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，這些復(fù)合物活性的改變會導(dǎo)致線粒體電化學(xué)梯度和ATP合成的降低[23]，有研究在擴(kuò)張型心肌病以及心肌缺血性疾病中，損害了線粒體呼吸鏈復(fù)合體物的活性，最終引起心力衰竭[24]。阿霉素能夠使包括線粒體呼吸鏈復(fù)合體物I和線粒體呼吸鏈復(fù)合體物Ⅱ的活性降低，引起持久的線粒體呼吸鏈的損害，同時長久阿霉素暴露引起MMP下降[25]。

我們通過實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，苦參堿預(yù)處理能夠顯著減輕阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡，其途徑可能是苦參堿顯著抑制了阿霉素引起的線粒體膜電位下降，提高了線粒體呼吸鏈復(fù)合物I的活性。在今后的實(shí)驗中我們繼續(xù)研究苦參堿對大鼠的心肌組織的保護(hù)作用。