劉 思 徐國前 張軍翔

(1 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2 寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

土壤微生物是反映土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，能對土壤環(huán)境變化迅速做出反應(yīng)[1]，直接影響土壤有機(jī)質(zhì)、土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成，在土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及多樣性上有著不可替代的作用[2-4]。寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄園長期采用清耕的土壤管理方法，使葡萄園土壤完全裸露，導(dǎo)致夏季土壤溫度過高，土壤干燥，不利于土壤微生物的生長和團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成[5]，這對于土壤生態(tài)脆弱的地區(qū)，無疑是雪上加霜。此外，葡萄在冬季修剪中產(chǎn)生大量枝條，冬剪葡萄枝條中含有豐富的N、P、K元素和大量的生物質(zhì)能源，是土壤養(yǎng)分的重要來源，而這些枝條多被丟棄或焚燒。如何經(jīng)濟(jì)有效的將這些有機(jī)資源應(yīng)用到葡萄園是寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)急需解決的重要問題。

枝條還田作為一種新型的土壤管理措施，目前在果園已有應(yīng)用。研究表明，修剪枝條還田能為土壤微生物提供豐富碳源，有利于土壤微生物的繁殖[6]。另外，枝條覆蓋還田能降低地表蒸發(fā)量[7-8]，達(dá)到改善土壤含水量的作用，并且能促進(jìn)有機(jī)物的分解，提高土壤的養(yǎng)分含量[9-10]。寧夏玉米栽培面積廣，玉米秸稈產(chǎn)生量大，葡萄園多將玉米秸稈進(jìn)行還田，而葡萄冬剪枝條多被丟棄或焚燒，未得到有效的利用。在該產(chǎn)區(qū)的土壤和氣候條件下，葡萄冬剪枝條還田對土壤微生物群落影響的研究也尚不明確。因此，本研究將葡萄冬剪枝條覆蓋在葡萄園行內(nèi)，同時設(shè)置玉米秸稈覆蓋處理，并以清耕為對照，利用高通量測序技術(shù)測定土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，以期了解葡萄冬剪枝條覆蓋對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，從而為推廣應(yīng)用葡萄冬剪枝條覆蓋提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于寧夏賀蘭山東麓金山子產(chǎn)區(qū)的蘭山云昊酒莊葡萄園(38°43′N，106°05′E)，土壤類型為礫石土，主要栽培品種為歐亞種釀酒葡萄赤霞珠(CabernetSauvignon)，于2013年定植，行株距4 m×0.8 m，南北行向，單籬架栽培，“廠”字形整形。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)設(shè)置3個處理，選擇樹體生長健壯，無病蟲害，樹勢相對一致的植株，分別于2017年4月和2018年4月連續(xù)2年將粉碎的葡萄枝條和玉米秸稈分別覆蓋在葡萄行內(nèi)，分別為葡萄枝條覆蓋處理(GC)和玉米秸稈覆蓋處理(CS)，粉碎程度均為2～3 cm的片狀碎屑，覆蓋厚度4 cm，寬度120 cm，以清耕為對照(CK)，每個處理3行葡萄，每行200 m。各處理葡萄的夏季肥水、修剪、病蟲害等管理措施均保持一致。

2018年10月3日，從3個處理的9個葡萄行內(nèi)進(jìn)行土樣采集。每個行內(nèi)隨機(jī)選取3個點(diǎn)，用剖面刀從0～60 cm土層內(nèi)取土，約200 g。其中，約10 g土放入無菌離心管中，并置于液氮內(nèi)速凍，然后置于-80℃冰箱中保存，用于土壤細(xì)菌總DNA的提取；另一部分土樣風(fēng)干過篩，用于測定土壤理化性狀。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 土壤細(xì)菌總DNA的提取 土壤細(xì)菌總DNA的提取，按照FastDNA Spin Kit for Soil(美國MP)試劑盒按說明書進(jìn)行操作。提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的完整性，然后將提取的DNA溶液置于-80℃保存。

1.3.2 細(xì)菌高通量測序 以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為16S rRNA V3區(qū)帶有Barcode的特異性引物342F(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和518R(5’-ATTACCGCGGCTGCT-3’)。PCR反應(yīng)體系為TaKaRa ex Taq 0.25 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物各1 μL，gDNA(5 ng·μL-1) 3 μL，水15.3 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s， 58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃補(bǔ)充延伸5 min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖電泳檢測，然后利用Ion Plus Fragment Library Kit建庫試劑盒(美國life公司)對混合樣品進(jìn)行文庫構(gòu)建，通過86952 Qubit(上海費(fèi)爾伯羅)檢測文庫濃度，Agilent 2200(安捷倫，中國)質(zhì)檢。質(zhì)檢合格后用IonS5測序儀(美國life公司)進(jìn)行測序。

1.3.3 土壤理化性狀測定 土壤堿解氮的測定采用堿解擴(kuò)散法，速效磷的測定采用鉬銻抗比色法，速效鉀的測定采用原子吸收分光光度計法，有機(jī)質(zhì)的測定采用重鉻酸鉀容量法[11]，pH值采用PHS-3C酸度計(上海雷磁)測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評估，去除低質(zhì)量序列后，采用Usearch軟件去除測序結(jié)果中的嵌合體序列(Chimera Sequence)，然后得到可以用于后續(xù)分析的序列。采用QiiME算法中的Uclust聚類策略對所有序列進(jìn)行聚類，并選取其中具有代表性的16S序列劃分操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，利用Silva數(shù)據(jù)庫(https://www.arb-silva.de/)對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，并對分析結(jié)果進(jìn)行Alpha多樣性分析；采用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析；采用Duncan’s檢驗(yàn)進(jìn)行多重差異顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

圖1為3種處理序列數(shù)與其所代表的OTU數(shù)目構(gòu)建的稀釋性曲線，結(jié)果表明，GC、CS和CK的有效序列分別為103 653、103 152、104 033條。3種處理的土壤樣品隨序列量的增加，OTU數(shù)目不斷上升，但有趨于平緩的趨勢，這說明有些物種未被測定出來，但土壤微生物樣品有效序列一般為60 000～70 000條就基本涵蓋絕大部分物種信息。此外，結(jié)合表1可知，不同覆蓋處理的覆蓋率值均大于86%，說明所測數(shù)據(jù)合理，能基本反應(yīng)土壤微生物群落組成。

由圖2可知，3種處理共有2 376個OTU，其中CS的OTU數(shù)目最多，為1 974個，GC有1 929個，CK只有1 838個，這說明CS的土壤微生物類群最豐富，CK的土壤微生物類群最少。另外，GC、CS和CK共有的OTU數(shù)為1 523個，占總OTU數(shù)的64.1%，表明3種處理的土壤微生物類群大部分是一致的，但整體來看，各處理之間還存在差異，其中GC與CS共有的OTU數(shù)為1 667個，與CK共有的OTU數(shù)為1 596， 說明GC與CS的土微生物類群一致性較高，與CK的土微生物類群一致性較低。

根據(jù)測序分析得到的物種注釋信息進(jìn)行Alpha多樣性分析。由表1可知，GC和CS的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均大于CK，說明2種覆蓋處理增加了土壤微生物數(shù)量，但差異不顯著，而CS的Shannon指數(shù)最大、Simpson指數(shù)最小、CK的Shannon指數(shù)最小，Simpson指數(shù)最大，且兩處理之間均達(dá)到了差異顯著水平，說明CS的土樣微生物群落多樣性最高，CK的土樣微生物群落多樣性最低。

圖1 相似度為97%條件下不同土壤樣品的稀釋曲線Fig.1 Eoch of different soil samples dilution curves on the condition of 97% similarity

圖2 屬水平下細(xì)菌物種韋恩圖Fig.2 The Venn map of bacterial community at genus level

表1 不同覆蓋處理土壤樣品微生物多樣性指數(shù)分析Table 1 Analysis of microbial diversity index in the soil samples with different covering treatments

圖3 不同覆蓋處理土壤樣品中細(xì)菌門組成Fig.3 Relative abundances of microbial phyla in different covering treatments

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

所有處理檢測到的細(xì)菌分屬于56個門，219個綱，536個目，981個科，2 376個屬。圖3為門水平上各處理細(xì)菌的分類，CS和GC土壤中變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和綠彎菌門(Chloroflexi)細(xì)菌相對豐度大于10%，是土壤中的優(yōu)勢菌落；而CK土壤中只有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門細(xì)菌相對豐度大于10%。3種處理細(xì)菌相對豐度含量最多的均為變形菌門，分別在CS、GC和CK中占細(xì)菌相對豐度的25.5%、21.2%和14.3%；其次是酸桿菌門，分別在CS、GC和CK中占細(xì)菌相對豐度的19.0%、19.2%和12.5%。CS和GC中相對豐度第三的是放線菌門，第四是疣微菌門；而CK中相對豐度第三的是綠彎菌門，第四是放線菌門。另外，CS、GC和CK中細(xì)菌相對豐度大于1%的主要細(xì)菌門類分別有10、9和8個。

對各處理組間在豐度上有顯著差異的物種進(jìn)行線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)。如圖4所示，由內(nèi)至外輻射的不同圓圈層分別代表了由門至屬的分類級別。各個節(jié)點(diǎn)代表該水平下的一個物種分類，該物種豐度越高節(jié)點(diǎn)越大。其中，黃色節(jié)點(diǎn)為無顯著差異的物種。差異物種生物標(biāo)記物則跟隨分組進(jìn)行著色，如紅色節(jié)點(diǎn)表示在CS中起到重要作用的微生物類群。結(jié)果表明，CS中優(yōu)勢菌主要有7種，分別為芽胞桿菌科(Bacillaceae)、Gemmatimonadaceae、硫還原菌科(Desulfurellaceae)、噬纖維菌科(Cytophagaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)和Alistipes，而GC中只有一種優(yōu)勢菌為擬桿菌科(Bacteroidaceae)，這說明CS和GC均可以提高土壤微生物多樣性，但以CS效果最好。

圖4 不同覆蓋處理土壤樣品中細(xì)菌優(yōu)勢菌種分析Fig.4 Analysis of dominant bacterial species in soil samples with different covering treatments

2.3 葡萄園土壤細(xì)菌菌落與土壤理化性質(zhì)

不同覆蓋處理土壤理化性質(zhì)如表2所示，該葡萄園土壤為堿性(pH值均大于8.2)，不同覆蓋處理間pH值差異不顯著。與CK相比，CS和GC顯著提高了土壤含水量，其中以GC提升效果較好，其土壤含水量為36.3%；另外，CS和GC也顯著提高了土壤堿解氮、速效磷和有機(jī)質(zhì)的含量，2種覆蓋處理中以CS提升效果較好，分別較CK增加了32.0%、37.8%和36.9%。但不同處理間土壤速效鉀含量差異不顯著。

由表3可知，變形菌門豐度與堿解氮、有機(jī)質(zhì)含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；酸桿菌門豐度與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)；放線菌門豐度與速效磷、有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)；疣微菌門豐度與土壤理化性狀無顯著相關(guān)性；而綠彎菌門豐度與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

表2 不同覆蓋處理土壤理化性質(zhì)Table 2 Soil physical and chemical properties with different mulching treatments

表3 細(xì)菌菌落與土壤理化性狀的相關(guān)關(guān)系Table 3 Correlation between bacterial and soil physical and chemical properties

Note：*and**indicate the correlation was significant and extremely significant at 0.05 and 0.01 level, respectively.

3 討論

土壤微域生態(tài)環(huán)境由植物、土壤微生物和土壤三者共同作用而成。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性在維持生態(tài)系統(tǒng)功能上有著重要作用[12-14]。研究表明，土壤有機(jī)質(zhì)的降解、轉(zhuǎn)化和養(yǎng)分的循環(huán)都是在土壤微生物的參與下完成的[15]，且土壤微生物隨土壤環(huán)境的改變而改變，能及時反映土壤的肥力狀況，并最終影響植物的生長[16-18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄園覆蓋葡萄枝條和玉米秸稈均可以提高土壤微生物菌落的豐度和多樣性。3種處理中變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門均為優(yōu)勢菌群，說明土壤雖然有不同的覆蓋處理，但處于相同生境中的土壤微生物類群具有相似性，這與劉洋等[19]的研究結(jié)果相似。而在優(yōu)勢菌群豐度上3種處理存在明顯差異，與CK相比，CS和GC分別提高了土壤變形菌門、酸桿菌門和放線菌門的豐度，這可能是由于葡萄園覆蓋顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)含量，而變形菌門和放線菌門與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著或極顯著正相關(guān)[20]，即土壤有機(jī)質(zhì)含量越高變形菌門豐度越高[21]。另外，葡萄園覆蓋降低了土壤pH值，而酸桿菌門具有嗜酸性，其豐度受pH值影響，土壤pH值降低有利于其生長[22-23]。但與CK相比，CS和GC降低了土壤綠彎菌門的豐度，這可能是由于綠彎菌門是一類利用二氧化碳，并通過光合作用產(chǎn)生能量的細(xì)菌，這種特性使得綠彎菌門在有機(jī)質(zhì)含量較低的土壤中具有優(yōu)勢[24]。

利用LDA分析發(fā)現(xiàn)，2種覆蓋處理顯著增加的優(yōu)勢菌群大部分為有益微生物，如芽胞桿菌科在土壤中具有固氮作用[25]；硫還原菌科對土壤硫循環(huán)具有重要作用[26]；噬纖維菌科是一種纖維素分解菌，具有較強(qiáng)的分解纖維素能力；而擬桿菌科相對豐富度與有效磷含量呈顯著正相關(guān)[27-28]。此外，這些微生物在改善果實(shí)品質(zhì)方面也具有重要作用[29]，如芽孢桿菌是植物促生菌，可提高果樹葉綠素含量，從而提高果實(shí)可溶性糖和可溶性蛋白的含量[30]。

4 結(jié)論

本研究通過對寧夏賀蘭山東麓葡萄園不同材料覆蓋下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析可知，在寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的土壤和氣候條件下，葡萄枝條覆蓋和玉米秸稈覆蓋均提高了土壤細(xì)菌的多樣性，主要增加了土壤中變形菌門、酸桿菌門和放線菌門等細(xì)菌群落的豐度。這些細(xì)菌在提高土壤養(yǎng)分方面具有一定作用。2種覆蓋處理中以玉米秸稈覆蓋較好，但考慮到葡萄園冬季修剪產(chǎn)生大量的枝條，提供了充足的覆蓋材料，因此葡萄枝條覆蓋也具有較高的可行性。