李佩艷 尹 飛 黨東陽(yáng) 甘瑞卿 李鑫玲 梁 華

(1河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院/河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023；2河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

芒果(MangiferaindicaL.)是典型的冷敏型果實(shí)，貯藏溫度低于13℃就會(huì)出現(xiàn)冷害現(xiàn)象[1]，主要表現(xiàn)為出現(xiàn)凹陷斑、果皮和果肉褐變、果肉硬度較高、不能正常后熟等[2-3]。冷害的發(fā)生會(huì)大大降低芒果食用價(jià)值和商品價(jià)值，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此研究控制芒果冷害技術(shù)及其冷害機(jī)理已成為芒果低溫貯藏中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

諸多研究表明草酸不僅可用于采后果實(shí)貯藏保鮮以延緩果實(shí)成熟衰老過(guò)程[4-5]，而且還能提高采后果實(shí)抗冷性，減輕冷害的發(fā)生[6-8]。果膠、纖維素、半纖維素等細(xì)胞壁物質(zhì)含量決定了采后果實(shí)的質(zhì)地，這些細(xì)胞壁物質(zhì)在果膠甲酯酶(pectin methyl enzyme，PME)、β-半乳糖苷酶(β-galactose glucoside enzyme，β-Gal)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)、纖維素酶(cellulase，Cx)等細(xì)胞壁代謝酶作用下會(huì)使細(xì)胞壁物質(zhì)發(fā)生降解，引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致果實(shí)軟化[9]。已有研究表明，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞壁代謝能提高采后果實(shí)抗冷性，減輕冷害程度[10]。芒果受冷害嚴(yán)重時(shí)，硬度會(huì)增加，后不能正常后熟和軟化，表明芒果冷害的發(fā)生與其細(xì)胞壁代謝有關(guān)。

先前研究表明草酸處理能降低采后芒果果實(shí)冷害的發(fā)生[1,11]，然而，低溫脅迫下草酸處理對(duì)采后芒果細(xì)胞壁代謝方面的研究尚不清楚，尤其是草酸處理后芒果冷害與細(xì)胞壁代謝之間的關(guān)系更鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以桂七芒果為試材，探究草酸處理對(duì)桂七芒果低溫貯藏期間冷害、細(xì)胞壁組分、細(xì)胞壁水解酶活性的影響，旨在進(jìn)一步揭示草酸減輕芒果冷害的機(jī)制，同時(shí)為草酸在桂七芒果果實(shí)低溫貯藏保鮮中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為其他冷敏型果蔬的低溫貯藏保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桂七芒果果實(shí)于2018年7月上旬采摘于廣西省百色市，約八成熟，空運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要儀器與試劑

MIR-553恒溫恒濕箱，日本SANYO公司；FHM-5硬度計(jì)，日本竹村電機(jī)制作所；UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；3-30K高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司；DDSJ-308A電導(dǎo)率儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

草酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、咔唑、半乳糖醛酸、蒽酮、葡萄糖、多聚半乳糖醛酸、Tris-HCl、氯化鈉(Nall)、乙二胺四乙酸、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、果膠、溴麝香草酚藍(lán)、巰基乙醇、乙酸、乙酸鈉、對(duì)硝基-β-D-半乳糖苷、碳酸鈉、羧甲基纖維素鈉、3，5-二硝基水楊酸、乙醇等均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇果形端正、大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)斑和機(jī)械損傷的果實(shí)，用5 mmol L-1草酸溶液浸泡10 min，以浸清水為對(duì)照。果實(shí)于陰涼處(25℃)風(fēng)干4 h，按每筐20個(gè)裝入塑料筐，筐外套厚度0.05 mm聚乙烯薄膜袋，袋不封口，置于4℃低溫貯藏28 d，常溫后熟4 d。貯藏期間分別于0、7、14、21、28、28+4 d，測(cè)定相關(guān)生理生化指標(biāo)，試驗(yàn)重復(fù)3次。其中，28+4 d為后熟階段。

1.3.2 冷害指數(shù) 參照Li等[11]的方法。芒果冷害指數(shù)統(tǒng)計(jì)按果實(shí)表面的凹陷及冷害斑的面積分為5級(jí)：0級(jí)，芒果果實(shí)表面未出現(xiàn)凹陷及冷害斑；1級(jí)，芒果果實(shí)表面發(fā)病面積小于果實(shí)總面積的10%；2級(jí)，芒果果實(shí)表面發(fā)病總面積為果實(shí)總表面積的10%～20%；3級(jí)，芒果果實(shí)表面發(fā)病面積為果實(shí)總表面積的20%～30%；4級(jí)，芒果果實(shí)表面發(fā)病面積大于果實(shí)總表面積的30%。每組選擇30個(gè)芒果果實(shí)。按照公式計(jì)算冷害指數(shù)：

冷害指數(shù)=Σ(病級(jí)果數(shù)×該級(jí)代表數(shù)值)/(調(diào)查總果數(shù)×最高級(jí)代表數(shù)值)×100%。

1.3.3 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測(cè)定 參考曹建康等[12]的硫代巴比妥酸法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定 參照Li等[1]的方法。每處理分別取5個(gè)芒果果實(shí)，均取赤道部位果肉，將其切成小圓片(直徑10 mm，厚3 mm)，取10個(gè)果實(shí)圓片放入小燒杯中加入30 mL水，測(cè)定煮沸前后溶液的電導(dǎo)率值，計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率。

1.3.5 硬度測(cè)定 參照Li等[11]的方法，每組選取10個(gè)芒果果實(shí)，選赤道處3個(gè)部位分別用硬度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，取平均值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 原果膠和水溶性果膠含量測(cè)定 參考曹建康等[12]的咔唑比色法測(cè)定，原果膠和水溶性果膠含量均以生成的半乳糖醛酸占樣品質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)表示。

1.3.7 纖維素含量測(cè)定 采用酸堿醇醚法測(cè)定[12]，以樣品經(jīng)處理后殘余物質(zhì)量占原樣品質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)表示。

1.3.8 細(xì)胞壁水解酶測(cè)定 PG活性參考何俊瑜等[13]的方法測(cè)定。稱取2 g芒果果肉加入6 mL Tris-HCl溶液(50 mmol·L-1，pH值7.0，內(nèi)含2 mol·L-1NaCl，10 mmol·L-1乙二胺四乙酸，5 g·L-1交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)，冰浴研磨，12 000 r·min-1離心20 min，上清液即為酶液。以每小時(shí)每克鮮樣37℃分解多聚半乳糖醛酸產(chǎn)生的游離半乳糖醛酸量表示，單位為mg·h-1·g-1FW。

PME活性參考徐曉波[14]的方法測(cè)定，略有改動(dòng)。稱取10 g芒果果肉加入10 mL NaCl研磨勻漿，12 000 r·min-1離心20 min，上清液即為酶提取液，加入2 mL 0.5%果膠、0.15 mL 0.01%溴麝香草酚藍(lán)溶液、0.1 mL酶液混合，測(cè)定620 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算PME活性，單位為△620 nm·g-1·min-1。

β-Gal活性參考葉玲[15]的方法測(cè)定。稱取2 g芒果果肉加入8 mL含有NaCl、巰基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮的乙酸-乙酸鈉緩沖液(50 mmol·L-1，pH值5.5)研磨成勻漿，12 000 r·min-1離心20 min，上清液即為酶提取液。試管中加入1 mL對(duì)硝基苯-β-D-半乳糖苷(3 mmol·L-1)，再加入0.1 mL酶提取液，37℃條件下水浴30 min，立即加入2 mL碳酸鈉溶液(1 mol·L-1)終止反應(yīng)，在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以每分鐘每克鮮樣37℃分解對(duì)硝基苯-β-D-半乳糖苷產(chǎn)生的對(duì)硝基酚量計(jì)算酶活性，單位為μmol·h-1·g-1FW。

Cx活性參考曹建康等[12]的方法測(cè)定。稱取10 g芒果果肉，加入20 mL預(yù)冷的95%乙醇，冰浴研磨，4℃ 12 000 r·min-1離心20 min，棄上清，沉淀加入5 mL預(yù)冷的乙酸-乙酸鈉緩沖液提取20 min，再次離心，上清液即為酶提取液。取0.5 mL酶液加入1.5 mL 10 g·L-1羧甲基纖維素鈉，37℃水浴60 min，加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，沸水浴5 min終止反應(yīng)，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，單位為mg·h-1·g-1FW。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有測(cè)定均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行Duncan多重比較和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草酸處理對(duì)桂七芒果果實(shí)冷害指數(shù)的影響

由圖1可知，桂七芒果冷害指數(shù)均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，對(duì)照組果實(shí)在貯藏14 d時(shí)出現(xiàn)冷害癥狀，而草酸處理組果實(shí)則在貯藏21 d時(shí)出現(xiàn)冷害癥狀。整個(gè)貯藏期間草酸處理組芒果冷害指數(shù)均顯著低于對(duì)照組，后熟結(jié)束時(shí)，草酸處理組芒果冷害指數(shù)比對(duì)照組降低了22.50個(gè)百分點(diǎn)。由此可見(jiàn)，草酸處理能夠提高低溫脅迫下桂七芒果的抗冷性，減輕其貯藏期間冷害的發(fā)生。

注：不同小寫(xiě)字母表示同一貯藏時(shí)間兩組間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different louercase letters indicate significant difference between different treatments at the same storage time at 0.05 level.圖1 草酸處理對(duì)桂七芒果果實(shí)貯藏期間冷害指數(shù)的影響Fig.1 Effects of oxalic acid treatments on chilling injury index in Guiqi mango fruit during storage

2.2 草酸處理對(duì)桂七芒果果實(shí)MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率的影響

由圖2-A、B可知，桂七芒果果實(shí)MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升。對(duì)照組果實(shí)MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率在整個(gè)貯藏過(guò)程中均高于草酸處理組，且在貯藏14～28+4 d期間，兩處理具有顯著差異。

2.3 草酸處理對(duì)桂七芒果果實(shí)硬度的影響

由圖3可知，貯藏前14 d，對(duì)照組和草酸處理組之間的芒果實(shí)硬度變化不大；貯藏21 d后，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和草酸處理組果實(shí)硬度均急劇下降，貯藏末期及后熟期(28～28+4 d)對(duì)照組果實(shí)硬度顯著高于草酸處理組。經(jīng)貯藏后熟后，草酸處理組芒果果實(shí)硬度較對(duì)照組低21.03%。

圖2 草酸處理對(duì)桂七芒果果實(shí)貯藏期間MDA含量(A)和相對(duì)電導(dǎo)率(B)的影響Fig.2 Effects of oxalic acid treatments on MDA content(A) and relative conductivity(B) in Guiqi mango fruit during storage

2.4 草酸處理對(duì)桂七芒果果實(shí)細(xì)胞壁組分含量的影響

原果膠是芒果果實(shí)細(xì)胞壁的主要成分之一，能保持果實(shí)組織堅(jiān)硬，但隨著果實(shí)成熟和衰老，原果膠會(huì)逐漸發(fā)生水解，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致果實(shí)組織變得松弛、軟化，硬度下降。由圖4-A可知，貯藏前21 d，兩組芒果果實(shí)原果膠含量變化不大，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，兩組果實(shí)中原果膠含量均呈急劇下降。但是，在整個(gè)貯藏過(guò)程中，草酸處理組果實(shí)中原果膠含量始終低于對(duì)照組，說(shuō)明草酸處理可以維持低溫脅迫下桂七芒果原果膠的正常降解，而對(duì)照組果實(shí)原果膠的降解受到了一定阻礙。

對(duì)照組和草酸處理組芒果水溶性果膠含量均呈逐漸上升趨勢(shì)(圖4-B)，這可能是由桂七芒果中原果膠轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄怨z引起的。草酸處理組貯藏前21 d芒果水溶性果膠上升緩慢，貯藏21 d后急劇上升；對(duì)照組芒果水溶性果膠貯藏前21 d期間變化不大，貯藏21 d后急劇上升。在整個(gè)貯藏和后熟期間，草酸處理組果實(shí)中水溶性果膠含量顯著高于對(duì)照組。后熟結(jié)束后，草酸處理組芒果水溶性果膠較對(duì)照組提高了17.08%，且芒果水溶性果膠增加的趨勢(shì)與原果膠降低的趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明草酸處理能維持桂七芒果原果膠的水解程度，水溶性果膠含量不斷增加。

圖3 草酸處理對(duì)桂七芒果果實(shí)貯藏期間硬度的影響Fig.3 Effects of oxalic acid treatments on firmness in Guiqi mango fruit during storage

由圖4-C可知，無(wú)論是草酸處理組還是對(duì)照組，桂七芒果果實(shí)中纖維素含量均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸下降的趨勢(shì)。草酸處理組纖維素含量在貯藏0～14 d期間急劇降低，之后緩慢下降，而對(duì)照組果實(shí)纖維素含量在貯藏0～21 d期間迅速下降，之后呈緩慢降低趨勢(shì)，在整個(gè)貯藏期間草酸處理組芒果中纖維素含量均顯著低于對(duì)照組。貯藏第28+4天時(shí)，草酸處理組桂七芒果中纖維素含量較對(duì)照組降低了1.47個(gè)百分點(diǎn)。

圖4 草酸處理對(duì)桂七芒果果實(shí)貯藏期間原果膠、水溶性果膠和纖維素含量的影響Fig.4 Effects of oxalic acid treatments on content of original pectin, water soluble pectin and cellulose in Guiqi mango fruit during storage

2.5 草酸處理對(duì)桂七芒果果實(shí)細(xì)胞壁代謝關(guān)鍵酶的影響

PG能夠切斷果膠分子中α-1,4-糖苷鍵而將果膠分子降解為小分子物質(zhì)。由圖5-A可知，低溫貯藏階段桂七芒果果實(shí)PG活性較低，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸上升趨勢(shì)；后熟階段，PG活性急劇上升，并達(dá)到最大值，此時(shí)草酸處理組PG活性是對(duì)照組的1.50倍。同時(shí)，兩組芒果果實(shí)PME活性也隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)均呈逐漸增加趨勢(shì)(圖5-B)，整個(gè)貯藏過(guò)程中，草酸處理組PME活性顯著高于對(duì)照組。β-Gal通過(guò)去除果膠多聚醛酸側(cè)鏈的半乳糖殘基使果膠解聚或溶解。由圖5-C可知，對(duì)照組和草酸處理組桂七芒果果實(shí)β-Gal活性在貯藏前14 d差異不大，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)兩者差值逐漸增大，后熟結(jié)束時(shí)，草酸處理組β-Gal活性是對(duì)照組的1.39倍。纖維素酶通過(guò)降解纖維素和半纖維素中的木葡聚糖，使細(xì)胞壁果膠-纖維素-半纖維素結(jié)構(gòu)破壞。由圖5-D可知，貯藏過(guò)程中桂七芒果纖維素酶活性呈逐漸上升趨勢(shì)，且草酸處理組纖維素酶活性始終高于對(duì)照組，后熟結(jié)束時(shí)，草酸處理組纖維素酶活性較對(duì)照組提高了45.89%。

圖5 草酸處理對(duì)桂七芒果果實(shí)貯藏期間PG、PME、β-Gal和Cx活性的影響Fig.5 Effects of oxalic acid treatment on activities of PG, PME, β-Gal and Cx in Guiqi mango fruits during storage

3 討論

桂七芒果的冷害癥狀主要表現(xiàn)為果皮出現(xiàn)凹陷、水漬狀斑點(diǎn)，果皮變暗失去光澤，果實(shí)硬度較高、不能正常軟化后熟。本試驗(yàn)結(jié)果表明，貯藏14 d后，低溫脅迫下草酸處理組芒果冷害指數(shù)、MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于對(duì)照組，貯藏28 d后對(duì)照組果實(shí)硬度顯著高于草酸處理組。說(shuō)明草酸處理組果實(shí)冷害程度及癥狀較輕，果實(shí)能正常后熟軟化，果實(shí)硬度較低，而對(duì)照組芒果果實(shí)受冷害程度嚴(yán)重，冷害癥狀明顯，果實(shí)不能正常后熟軟化，果實(shí)硬度較高。這也表明草酸處理減輕桂七芒果冷害與其維持桂七芒果果實(shí)細(xì)胞膜完整性，減少胞內(nèi)物質(zhì)滲出有關(guān)。

果實(shí)細(xì)胞壁主要由果膠、纖維素等物質(zhì)構(gòu)成，它們?cè)赑G、PME、Cx、β-Gal等作用下發(fā)生降解，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體、果實(shí)軟化[16-17]。魏建梅等[18]認(rèn)為京白梨果實(shí)軟化與細(xì)胞壁組分密切相關(guān)，β-Gal促進(jìn)了果實(shí)早期軟化，PME、PG促進(jìn)了果實(shí)后期軟化，而Gx作用不大。梁潔玉等[19]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁酶活性變化對(duì)半邊紅李子果膠降解及果實(shí)軟化影響較大，低溫能夠在一定程度上抑制細(xì)胞壁酶活性，降低果膠的代謝速率。陳克明等[20]認(rèn)為引起水蜜桃果實(shí)冷害的重要原因是低溫冷藏期間果膠類物質(zhì)代謝異常。本試驗(yàn)結(jié)果表明，貯藏過(guò)程中，草酸處理組桂七芒果中原果膠和纖維素含量總體顯著低于對(duì)照組，且草酸處理能顯著促進(jìn)原果膠在貯藏后期的降解，加速了纖維素在貯藏前期的降解，這表明原果膠和纖維素等含量降低是導(dǎo)致桂七芒果硬度下降的主要原因。

果實(shí)冷害的發(fā)生還與細(xì)胞壁代謝密切相關(guān)，這在黃瓜[10]、桃[21-23]、枇杷[24]和橄欖[25]等果蔬中已得到證實(shí)。低溫脅迫會(huì)造成果實(shí)細(xì)胞壁纖維素和果膠質(zhì)降解過(guò)程受阻[22-25]，冷害果實(shí)和正常果實(shí)中纖維素和果膠質(zhì)降解過(guò)程受阻程度不同。果實(shí)細(xì)胞壁代謝酶PME、PG等活性不平衡會(huì)抑制果實(shí)正常的中膠層水解進(jìn)程，導(dǎo)致果實(shí)出現(xiàn)木質(zhì)化、細(xì)胞壁代謝異常，從而引起果實(shí)冷害的發(fā)生。采用熱處理[26-28]、γ-氨基丁酸處理[22]等能調(diào)控低溫貯藏果實(shí)細(xì)胞壁代謝酶活性，促進(jìn)細(xì)胞壁物質(zhì)水解，維持果膠物質(zhì)正常降解，從而減輕采后果實(shí)冷害的發(fā)生。本研究表明，草酸處理降低了桂七芒果原果膠含量，提高了水溶性果膠含量，提高了PG、β-Gal、Cx、PME等細(xì)胞壁降解酶活性，說(shuō)明草酸處理能提高果實(shí)細(xì)胞壁代謝關(guān)鍵酶，活性維持正常的細(xì)胞壁代謝。草酸處理降低桂七芒果冷害發(fā)生與其維持低溫脅迫下果膠物質(zhì)正常降解、提高可溶性果膠含量有關(guān)，這可能是草酸減輕桂七芒果冷害的原因之一。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，草酸處理能顯著促進(jìn)低溫貯藏14 d后桂七芒果中原果膠和纖維素的降解，顯著提高貯藏14 d后芒果果實(shí)中水溶性果膠、PG、PME、Cx活性，顯著提高貯藏21 d后β-Gal活性、通過(guò)維持采后果實(shí)細(xì)胞壁降解酶較高活性和水溶性果膠含量，從而減輕冷害的發(fā)生。本研究結(jié)果不僅為進(jìn)一步揭示草酸減輕芒果果實(shí)冷害機(jī)制提供了理論依據(jù)，而且對(duì)指導(dǎo)芒果果實(shí)低溫貯藏保鮮具有一定的實(shí)際意義，同時(shí)也為草酸應(yīng)用于其他冷敏型果實(shí)的貯藏保鮮提供了理論參考。