石 娟 李勇勇 周麗萍 李超群 王 晴 唐道軍 婁永江,*

(1 寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315211；2 寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211)

中華管鞭蝦(Solenoceramelantho)，又名紅蝦，是我國重要的海捕蝦之一[1]。蝦類富含蛋白質和水分，極易腐敗變質，冷凍保藏是主要的貯藏方式[2]。水產品凍藏過程中的品質與凍結方式有很大關系[3]，不同凍結方式對水產品的理化性質及品質影響也不同[4-7]。

近年來，蛋白質組學技術在水產品品質上的研究越來越多，如李娜[8]利用蛋白質組學技術研究羅非魚冰藏過程中肌肉蛋白質的變化，鑒定出3個鮮度指示蛋白。趙巧靈[9]利用蛋白質組學技術研究金槍魚冷藏過程中肌肉蛋白質的變化，確定了10個鮮度指示蛋白，且這10個蛋白主要通過組織蛋白酶途徑和糖酵解代謝途徑影響魚肉的品質變化。Terova等[10]研究不同溫度儲存期間鱸魚肌肉蛋白質的變化，發(fā)現了2種可能成為監(jiān)測魚類新鮮度的指示蛋白。非標記(label-free)定量蛋白質組學技術是常用的蛋白組學分析方法，檢測蛋白質靈敏度高，可獲得低豐度蛋白的信號，分離能力較強，適用范圍較廣[11]，但鮮見利用該技術分析不同凍結方式對中華管鞭蝦肌肉蛋白質品質變化影響的研究報道。

本研究運用label-free定量蛋白質組學技術鑒定4種凍結方式下中華管鞭蝦蝦肉差異蛋白的表達情況，通過基因本體(gene ontology, GO)分析差異蛋白的細胞組成、分子功能及其參與的生物過程，通過直采同源蛋白質族(cluster of orthologous groups of proteins，KOG，原核生物使用COG數據庫，真核生物使用KOG數據庫)注釋分析差異蛋白可能的功能并對這些功能分類，通過京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析差異蛋白參與的主要信號通路，通過Pearson相關性分析探究差異蛋白與蝦品質之間的相關性，旨在進一步了解蝦在凍結過程中的品質變化機制，尋找與蝦肉品質變化相關的蛋白質，旨在為評價中華管鞭蝦的新鮮度提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華管鞭蝦購于浙江寧波當地水產市場，大小均一，體表無損傷。

十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、三(羥甲基)氨基烷(Tris hydroxymethyl) methyl amznomethane， THAM)，美國Amresco公司；碳酸氫銨(NH4HCO3)、尿素(urea)、甲酸(formic acid，FA)、氨水(HPLC分級)、乙腈(acetonitrile，CAN)，美國Sigma公司；二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA)，美國Genview公司；胰酶，美國Promega公司；蛋白Marker，美國Invitrogen公司；動物組織總蛋白提取試劑盒購于北京邦菲生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

H4MFPTAD酶標儀，美國Bio Tek公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠；Orbitrap Fusion質譜儀，Easy nLcUltimate 3000液相，C18質譜柱(1.9 μm×150 μm×120 mm)，Orbitrap Fusion質譜儀、Pico 17 Centrifuge高速離心機、SC210A熱干濃縮儀，美國Thermo Scientific公司；TA.XT質構儀，英國Stable Micro Systems公司；CR-400色差儀，日本柯尼卡美能達公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 凍結方法 將新鮮蝦沖洗干凈擦拭后，隨機分成4組，分別置于-20℃環(huán)境開始凍結并用溫度計測得蝦體中心溫度變化。4種凍結方式處理分別為：液體浸漬凍結(immersion chilling and freezing，ICF-0)、真空包裝結合浸漬凍結(ICF-1)、靜止空氣凍結(static air freezing，SAF-0)、真空包裝結合空氣凍結(SAF-1)；其中液體為預冷至-20℃的飽和氯化鈉溶液，當中心溫度達到-18℃時視為凍結完成。自然解凍后進行品質指標的測定，同時將用于蛋白質組學研究的樣品立即放入液氮中進行冷凍備用。

1.3.2 色差、質構、pH值的測定 利用色差儀測定帶殼中華管鞭蝦第二、第三腹節(jié)表面的明亮度(L*)、紅綠度(a*)、黃藍度(b*)，重復測定20次。取蝦第二、第三腹節(jié)肌肉置于質構儀上測定其硬度、彈性；探頭為直徑3 mm的圓柱形，測試速度為1 mm·s-1，測試形變量為50%，重復測定6次。pH值參照GB 5009.237-2016[12]進行測定。

1.3.3 蛋白制備方法 采用試劑盒提取各凍結方式處理的中華管鞭蝦組織蛋白，并依據Bradford[13]的方法進行蛋白定量。

1.3.4 蛋白檢測方法 各取30 μg蛋白質樣品，5∶1(體積比)加入5×上樣緩沖液，沸水浴5 min，離心10 min取上清，進行10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。電泳條件：恒流14 mA，電泳時間90 min。凝膠分離后，通過考馬斯亮蘭法染色。

1.3.5 蛋白酶解及質譜分析 蛋白質定量后取60 μg蛋白溶液置于離心管中，加入5 μL 1 mol·L-1DTT溶液混勻，37℃保溫1 h。加入20 μL 1 mol·L-1IAA溶液，混勻后，室溫避光反應1 h。吸取所有樣品加入超濾管中，離心后棄收集液。加入100 μL尿酸(8 mol·L-1urea，100 mmol·L-1Tris-HCl，pH值8.0)至超濾管中，離心后棄收集液，重復2次。加入100 μL 50 mmol·L-1NH4HCO3溶液，離心后棄收集液，重復3次。更新收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，按照蛋白和酶50∶1 (m∶m)的比例加入，37℃酶解12～16 h。

每份樣品采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)系統(tǒng)進行分離。色譜柱以95%的流動相A(含0.1%的甲酸水溶液)平衡。流動相B為80%的CAN(含0.08%FA)。樣品由自動進樣器上樣到質譜預柱，再經分析柱分離，流速及相關液相梯度如表1。每份樣品經毛細管高效液相色譜分離后用質譜儀進行質譜分析。

表1 液相色譜洗脫梯度參數Table 1 Liquid chromatography elution gradient parameters

1.3.6 生物信息學數據分析 使用數據庫：uniprot-decapoda20180820進行檢索及定量分析。搜庫軟件：Proteome Discover。在1.5差異倍數(fold change，FC)且P<0.05條件下進行差異蛋白篩選(即FC≥1.5為上調，FC≤0.67為下調，0.67

2 結果與分析

2.1 不同凍結方式的中華管鞭蝦中心溫度變化趨勢

不同凍結方式的蝦體中心溫度變化如圖1所示，即ICF-0、ICF-1、SAF-0、SAF-1組處理完成凍結時間分別為12、73、158、210 min。液體浸漬凍結組的降溫速率快于空氣凍結組，這可能是因為液體降溫介質比空氣速度快；其中ICF-0組的降溫速率最快，ICF-1次之，可能是因為真空包裝有一定的阻隔作用，從而影響了中華管鞭蝦的降溫速率。

圖1 中華管鞭蝦中心溫度變化曲線Fig.1 Temperature variation curve of Solenocera melantho

圖3 蛋白質肽段數量Fig.3 Distribution of protein peptide number

2.2 SDS-PAGE電泳結果

凝膠電泳結果如圖2所示，5例樣本(CK為新鮮中華管鞭蝦)整體蛋白Pattern具有相似的帶型，蛋白條帶清晰、完整、均一，符合檢測要求。

圖2 不同處理組中華管鞭蝦的凝膠電泳結果Fig.2 Results of gel electrophoresis of Solenocera melantho in different treatment groups

2.3 蛋白質的鑒定統(tǒng)計

將蛋白質酶解得到的肽段進行質譜分析，得到肽段數為3 552個，鑒定到的總蛋白組數為750個。結果顯示，label-free定量蛋白質組學技術鑒定到的蛋白質比較全面且可靠。在所有鑒定到的蛋白質中，有68.00%的蛋白質至少含有2個肽段，有92.80%的蛋白質含有肽段數在20個以內(圖3-A)。鑒定到的蛋白質有著較高的序列覆蓋度，其中52.80%的蛋白質具有超出10%的序列覆蓋度(圖3-B)。

2.4 差異蛋白統(tǒng)計及分析

不同處理組中華管鞭蝦的差異蛋白結果見表2。不同凍結方式分別與CK比較，即ICF-0/CK、ICF-1/CK、SAF-0/CK、SAF-1/CK，4個比較組中都含有上調蛋白和下調蛋白，且下調蛋白多于上調蛋白，表明在凍結過程中蝦肉蛋白質發(fā)生了變化，其中ICF-1總差異蛋白最少，且遠小于其他3組，表明真空包裝結合浸漬凍結技術使得蛋白質發(fā)生的變化遠小于其他3組，保鮮效果優(yōu)于其他3組；其次是ICF-0組，SAF-0、SAF-1組差異蛋白數最多且相近，表明這2種凍結技術對蝦肉蛋白質產生的變化影響不明顯。42個差異蛋白為4組共有的差異蛋白(表3)，可能成為與凍結中華管鞭蝦品質變化相關的指示蛋白標志物。

2.5 差異表達蛋白生物信息功能分析

2.5.1 GO分析 對4種凍結方式下差異表達蛋白進行GO功能分析，如圖4所示，ICF-0/CK、ICF-1/CK、SAF-0/CK、SAF-1/CK比較組的差異蛋白在生物過程分類中均主要參與細胞過程(各占38.29%、40.12%、42.47%、41.52%)、代謝過程(各占24.54%、27.16%、30.43%、32.10%)和生物學調控(各占9.67%、6.79%、10.03%、8.30%)；在細胞組成分類中均主要分布在細胞(各占40.15%、40.74%、44.82%、44.29%)、細胞部分(各占38.66%、40.12%、42.81%、42.91%)和細胞器(各占24.54%、30.25%、28.43%、29.07%)；在分子功能分類中均主要分布在結合(各占56.88%、58.02%、55.52%、56.40%)和催化活性(各占43.87%、44.44%、48.49%、46.02%)。

表2 不同處理組中華管鞭蝦的差異蛋白結果(FC=1.5)Table 2 Differential protein results of Solenocera melantho in different treatment groups (FC=1.5)

圖4 中華管鞭蝦各比較組中差異蛋白的GO功能注釋Fig.4 GO function annotation of differential proteins in different comparison groups of Solenocera melantho

2.5.2 KOG分析 4種凍結方式處理后的蝦肉差異蛋白具有不同的功能，共25種，其中J、A、K、L、B歸為信息存儲和處理一類，D、Y、V、T、M、N、Z、W、U、O歸為細胞過程和信號一類，C、G、E、F、H、I、P、Q歸為代謝一類，R、S歸為很少特征一類。由圖5可知，Z、O、J功能蛋白質數量最多，說明凍結主要影響中華管鞭蝦蛋白質關于Z、O、J方面的功能。

2.5.3 KEGG通路分析 KEGG通路分析表明，ICF-0/CK、ICF-1/CK、SAF-0/CK、SAF-1/CK比較組的差異蛋白均主要參與代謝通路(各占13.38%、12.96%、20.07%、18.34%)、吞噬(各占10.41%、12.96%、8.03%、10.03%)、核糖體(各占7.06%、9.88%、7.36%、7.27%)等通路(圖6)。經不同凍結方式處理過的中華管鞭蝦的差異蛋白主要和代謝通路有關，表明凍結處理后蝦肉的差異蛋白主要與物質代謝有關。

2.6 差異蛋白與品質指標的相關性分析

中華管鞭蝦在凍結過程中的品質變化是多種因素共同作用的結果，僅從單一的指標來評價新鮮度不夠全面，需要從多個指標進行判定。水產品在停止呼吸后體內生成乳酸，從而導致pH值下降，因此pH值是評價肌肉新鮮度的重要指標[14]。在凍結過程中，蝦因本身含有的蝦青素等有色物質的變化及發(fā)生的酶促褐變反應都會使蝦肉的色澤發(fā)生改變，因此可以通過色澤的改變來評價蝦肉的品質[15]。水產品的質構特性是評價水產品新鮮度的重要指標，可以減少因主觀人為因素造成的評價誤差[16]。因此，本研究選取6個在凍結過程中較敏感的品質指標，即L*值、a*值、b*值、硬度、彈性，但并不是每個指標之間都存在相關性，因此需要對各個指標之間進行相關性分析，更有利于篩選出評價蝦新鮮度的主要指標[17]。由表4可知，液體浸漬凍結的pH值、L*值、a*值、b*值、硬度、彈性指標優(yōu)于空氣凍結。由表5可知，凍結中華管鞭蝦的L*值、a*值、b*值及硬度4個指標之間存在顯著或極顯著相關，而pH值、彈性之間無相關性，進一步說明可以將L*值、a*值、b*值及硬度作為評價蝦新鮮度的主要指標。

通過相關性分析能更加深入了解差異蛋白與品質之間的相關性[18]。相關性分析表明，有5個差異蛋白與4個指標中的至少一個指標的變化呈顯著相關(表6)，除去未表征蛋白和片段蛋白，共篩選出3個差異蛋白，分別是甘油-3-磷酸脫氫酶(NAD+)[glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD+)，G3PDH(NAD+)](登錄號AOAOP4WGNO)、β-胸腺素(登錄號AOAOE3EKX5)和β-肌動蛋白(登錄號Q8WPD5)。G3PDH(NAD+)和β-胸腺素與4個指標之間都存在顯著或極顯著相關性，而β-肌動蛋白只與蝦L*值存在顯著相關，進一步說明G3PDH(NAD+)和β-胸腺素這2個差異蛋白有望成為中華管鞭蝦凍結過程中品質變化的指示蛋白。

3 討論

凍結速率較快對水產品品質造成的影響較小。本研究通過測得中華管鞭蝦蝦體中心溫度的變化得出液體浸漬凍結是最佳的凍結方式。Makri[19]證實了凍結時間越短，扇貝肉的品質損失就越小。董佳等[20]研究發(fā)現液體浸漬冷凍相比于傳統(tǒng)空氣冷凍能更好地保持鱘魚品質?？紤]到測得的總差異蛋白數、品質指標及實際應用中水產品表面的液體問題，認為真空包裝結合浸漬凍結為最佳凍結方式。

分析鮮度指示蛋白能為后續(xù)評價中華管鞭蝦品質提供理論參考。甘油-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehype-3-phosphate dehydrogenase, G3PDH)為氧化還原酶，在甘油代謝和磷脂合成中起重要作用[21-22]。G3PDH(NAD+)在4組比較組中的生物過程中均參與碳水化合物代謝過程、甘油-3-磷酸代謝過程；在細胞組成分類中均是甘油-3-磷酸脫氫酶復合物；在分子功能分

注：J：翻譯，核糖體結構和生物起源；A： RNA加工和修飾；K：轉錄；L：復制、重組和修復；B：染色質結構和動力學；D：細胞周期控制，細胞分裂，染色體分割；Y：核結構；V：防御機制；T：信號轉導機制；M：細胞壁/膜/包膜生物起源；N：細胞運動；Z：細胞骨架；W：細胞外結構；U：細胞內運輸，分泌和囊泡運輸；O：翻譯后修飾，蛋白質周轉，伴侶蛋白；C：能源生產和轉換；G：碳水化合物的運輸和代謝；E：氨基酸運輸和代謝；F：核苷酸運輸和代謝；H：輔酶運輸和代謝；I：脂質運輸和代謝；P：無機離子運輸和代謝；Q：次生代謝產物的生物合成，運輸和分解 代謝；R：一般功能；S：未知功能。Note: J: Translation, ribosome structure and biological origin. A: RNA processing and modification. K: Transcription. L: Copy, reorganize and repair. B: Chromatin structure and dynamics. D: Cell cycle control, cell division, chromosome division. Y: Nuclear structure. V: Defense mechanism. T: Signal transduction mechanism. M: Cell wall/membrane/envelope biological origin. N: Cell movement. Z: Cytoskeleton. W: Extracellular structure. U: Intracellular transport, secretion and vesicle transport. O: Translation modification, protein conversion and chaperone. C: Energy production and conversion. G: Carbohydrate transport and metabolism. E: Transport and metabolism of amino acids. F: Nucleotide transport and metabolism. H: Coenzyme transport and metabolism. I: Transport and metabolism of lipid. P: Transport and metabolism of inorganic ions. Q: Biosynthesis, transportation and catabolism of secondary metabolites. R: General function. S: Unknown function.圖5 中華管鞭蝦各比較組中差異蛋白KOG注釋Fig.5 Differential protein KOG annotation in each comparison group of Solenocera melantho

表4 不同凍結方式下中華管鞭蝦的品質特性Table 4 Quality characteristics of Solenocera melantho under different freezing methods

圖6 各比較組中差異蛋白KEGG通路分析(前20條)Fig.6 Analysis of differential protein KEGG pathway in each comparison group (top 20)

表5 中華管鞭蝦各指標相關性Table 5 Correlation of various indicators of Solenocera melantho

類中均是G3PDH(NAD+)活性、NAD結合及蛋白質同源二聚活性，且都參與甘油磷脂代謝通路。相關性分析顯示G3PDH(NAD+)與蝦L*值呈顯著正相關，與a*值、硬度呈極顯著負相關且與b*值呈顯著負相關。說明G3PDH(NAD+)的變化會影響蝦肉的色澤與硬度。因為凍結會導致蝦肉蛋白質變性，從而使一部分蝦青素游離出來，使a*值增加[23-24]。在多酚氧化酶的作用下，蝦肉氧化產生醌類物質，醌類物質與蝦體內的蛋白質或氨基酸結合發(fā)生褐變，從而使b*值增加[25]。此外，凍結過程中形成的冰晶會使肌肉損傷以及蛋白質變性，從而導致硬度增加。G3PDH(NAD+)在4個比較組中均表達下調，其中ICF-1/CK比較組較其他3組下調最為緩慢(表3)，可能是因為凍結過程中受到冷應激的影響[26]，而ICF-1處理使G3PDH(NAD+)參與的代謝過程時間縮短，從而延緩了蝦肉品質的劣變。胸腺素又稱肌動蛋白結合蛋白，根據等電點的不同將其分為α、β、γ三類，β-胸腺素的等電點在5.0～7.0之間[27]。β-胸腺素能夠與球狀肌動蛋白相互作用，在維持細胞骨架、細胞運動等方面有重要作用[28-29]。β-胸腺素在4個比較組中的生物過程中均參與肌動蛋白絲組織，在分子功能分類均是肌動蛋白單體結合。相關性分析顯示，β-胸腺素與蝦L*值呈顯著正相關，與a*值呈極顯著負相關，與b*值呈顯著負相關，與硬度呈極顯著負相關。說明β-胸腺素的變化也會影響蝦肉的色澤和硬度。β-胸腺素在4個比較組中均表達下調，且在ICF-1/CK比較組中下調最為緩慢(表3)，進一步說明真空包裝結合浸漬凍結能更好地維持細胞骨架，延緩蛋白降解，從而保證蝦肉的品質。

表6 差異蛋白與中華管鞭蝦在不同凍結方式下品質指標的相關性分析Table 6 Correlation analysis of differential proteins and quality index of Solenocera melantho under different freezing methods

本研究從蛋白質組學角度探究了可能成為蛋白標志物的2個差異蛋白，對凍結過程中華管鞭蝦的品質監(jiān)測提供了理論依據。但2個差異蛋白之間的相互作用關系還需作進一步的探究。

4 結論

本研究篩選出4組中的差異蛋白均主要分布在細胞、細胞部分和細胞器中；分子功能分類中主要分布在結合活性和催化活性；篩選出甘油-3-磷酸脫氫酶(NAD+)和β-胸腺素與中華管鞭蝦的L*、a*、b*值及硬度呈顯著相關；液體浸漬凍結的pH值、L*值、a*值、b*值、硬度、彈性指標優(yōu)于空氣凍結，且真空包裝結合浸漬凍結總差異蛋白數較其他3組最少。本研究結果從蛋白質組學層面解釋了中華管鞭蝦在凍結過程中的品質變化機制，同時也為凍結工藝技術提供了參考。