袁欣捷 方 榮 周坤華 雷 剛 黃月琴 陳學軍

(江西省農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，江西 南昌 330200)

辣椒(Capsicumspp.)為茄科辣椒屬蔬菜，2018年我國辣椒播種面積達213.3萬hm2，在蔬菜作物中位居第一[1]。隨著人們生活水平的提高，對辣椒品質和多樣性的需求越來越高，給育種者帶來了新的挑戰(zhàn)。株高、始花節(jié)位、單果質量、果縱徑、果橫徑、果形指數(shù)和果肉厚度是辣椒重要農藝性狀，與其產量和品質密切相關，然而這些性狀一般為數(shù)量性狀，受多基因控制，易受外部環(huán)境因素影響[2-4]。連鎖作圖(linkage mapping)與關聯(lián)分析(association analysis)是研究植物數(shù)量性狀的主要方法，已廣泛應用于農作物有益基因的挖掘[5-7]。

前人基于連鎖作圖方法，鑒定了辣椒株高、始花節(jié)位、單果質量、果縱徑、果橫徑、果形指數(shù)和果肉厚度等性狀的諸多數(shù)量性狀位點(quantitative trait loci, QTL)，如Rao等[8]基于種間雜交的248株BC2植株檢測到fw2.1等8個單果質量QTLs、fl2.1等6個果縱徑QTLs、fs-3.1等4個果形指數(shù)QTLs和perwd1.1 等8個果肉厚度QTLs；Dwivedi等[9]基于重組自交系群體鑒定到株高QTL位點Qpht.iivr.5.1、果縱徑QTLs位點Qfl.iivr.3.2和Qfl.iivr.3.4及果肉厚度QTL位點Qpt.iivr-2.1；Han等[10]基于120株重組自交系定位到6個株高QTLs、6個果縱徑QTLs、4個果形指數(shù)QTLs和6個單果質量QTLs；周坤華等[11]聯(lián)合應用辣椒種間F2和F2∶3兩個群體，檢測出株高、始花節(jié)位及果實相關性狀共19個QTLs。上述研究結果為在分子水平上解析辣椒數(shù)量性狀遺傳機理提供了重要參考。但連鎖作圖分析方法受雙親遺傳背景的限制，一個基因座只有2個等位基因，解析效率有限。而關聯(lián)分析以自然群體為材料，無需耗時構建作圖群體，能在眾多種質材料中同時考察同一基因座的所有等位基因，找出關聯(lián)位點[12-13]。

江西省農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所茄果類蔬菜研究室前期基于簡單重復序列(simple sequence repeat, SSR)標記技術，對194份辣椒核心種質材料進行了群體結構分析與辣椒疫病抗性關聯(lián)分析[14]，本試驗在前期研究基礎上，進一步深入對上述194份種質材料的株高、始花節(jié)位、單果質量、果縱徑、果橫徑、果形指數(shù)和果肉厚度等重要農藝性狀進行關聯(lián)分析，以期找出顯著關聯(lián)SSR位點，挖掘優(yōu)異等位變異及其載體材料，為辣椒相關農藝性狀優(yōu)異基因的發(fā)掘、分子標記輔助選擇與聚合育種提供理論指導和材料基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為本研究前期構建的辣椒核心種質[15-16]中的194份一年生辣椒(Capsicumannuum)材料(表1)，包含櫻桃椒(C.annuumvar.cerasiforme)、圓錐椒(C.annuumvar.conoides)、簇生椒(C.annuumvar.fascicutatum)、燈籠椒(C.annuumvar.grossum)和長椒(C.annuumvar.longum)5個變種。

表1 辣椒種質材料7個農藝性狀表型值Table 1 The data of seven agronomic traits of the tested pepper

表1(續(xù))

表1(續(xù))

表1(續(xù))

表1(續(xù))

1.2 田間試驗及性狀調查

供試材料播種于江西省農業(yè)科學院蔬菜基地，采用大棚育苗定植，每份材料定植8株，隨機取3株進行定株、定時觀測記載，取平均值。定植行株距為65 cm × 40 cm，四周設保護行，田間管理與常規(guī)相同。

定植后50 d測定株高和始花節(jié)位，在座果盛期隨機選取植株中部已充分發(fā)育的青熟果實3個(來自3株不同植株)測定單果質量、果縱徑、果橫徑、果形指數(shù)(果縱徑/果橫徑)和果肉厚度，取平均值。果縱徑為果實縱剖面最長處即果頂?shù)焦康拈L度，果橫徑為果實最寬處橫截面的直徑，果肉厚度為果實最寬處橫截面果肉的厚度。

1.3 SSR標記基因型鑒定

利用58對SSR引物[17-20]檢測供試材料基因型。PCR反應體系：10×Buffer 1 μL，Mg2+0.8 μL，正向和反向引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，dNTPs 0.2 μL，Taq酶0.1 μL，滅菌超純水5.1 μL，模板DNA 2 μL。PCR程序：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，以引物對中Tm值較低的引物Tm值減5℃作為退火溫度，退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。使用6%聚丙烯酰胺凝膠，銀染法檢測，統(tǒng)計多態(tài)性條帶。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 22軟件統(tǒng)計分析辣椒農藝性狀，對各農藝性狀進行正態(tài)性檢測，對不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進行正態(tài)轉換?；谇捌趯┰?94份辣椒核心種質群體結構分析數(shù)據(jù)[14]，利用TASSEL 3.0軟件中的廣義線性模型(general linear model，GLM，Q)和混合線性模型(mixed linear model，MLM，Q+K)方法檢測關聯(lián)位點。根據(jù)無效等位變異方法[21]計算位點等位變異的表型效應，若效應值為正，則為增效等位變異，反之為減效等位變異。

2 結果與分析

2.1 供試材料7個農藝性狀的表型變異與相關分析

194份辣椒核心種質農藝性狀表型值詳見表1。7個農藝性狀表型變異系數(shù)為20.01%～121.23%，均大于20%，說明供試材料的表型變異豐富。其中，單果質量變異系數(shù)最大，為121.23%，變幅為1.1～ 246.7 g；株高變異系數(shù)最小，為20.01%，變幅為27.0～ 89.0 cm(表2)。

由表3可知，7個農藝性狀間存在不同程度的相關性。株高與始花節(jié)位、果形指數(shù)，單果質量與果橫徑、果肉厚度，果縱徑與果形指數(shù)、果肉厚度，果橫徑與果肉厚度之間均存在顯著或極顯著正相關性；株高與單果質量、果橫徑、果肉厚度，始花節(jié)位與單果質量、果縱徑、果橫徑、果肉厚度，單果質量與果形指數(shù)，果橫徑與果形指數(shù)，果形指數(shù)與果肉厚度之間則呈顯著或極顯著負相關。

2.2 不同亞群種質農藝性狀變異分析

群體結構分析將194份辣椒核心種質分為亞群1和亞群2兩個亞群，分別包含126份和68份材料[14]。對兩個亞群的7個農藝性狀進行比較分析，結果顯示(圖1)，除果縱徑外，亞群1與亞群2在株高、始花節(jié)位、單果質量、果橫徑、果形指數(shù)和果肉厚度方面均存在顯著或極顯著差異，亞群1的株高、始花節(jié)位和果形指數(shù)大于亞群2，但單果質量、果橫徑和果肉厚度則小于亞群2，7個農藝性狀的盒形圖較為直觀地反映了兩個亞群間的差異。

表2 辣椒7個農藝性狀變異分析Table 2 Variation analysis for seven agronomic traits of pepper

表3 農藝性狀相關分析Table 3 Correlation analysis among agronomic traits

注：箱圖兩端表示性狀的極值范圍；中間直線表示性狀中位數(shù)；“*”表示兩亞群間存在顯著性差異(0.01

2.3 辣椒農藝性狀與SSR標記的關聯(lián)分析

GLM方法共檢測到20個SSR標記與7個性狀顯著關聯(lián)(P< 0.05)，其中，14個SSR標記與7個性狀極顯著關聯(lián)(P< 0.01)。顯著關聯(lián)位點中，各位點對表型變異的貢獻率為2.09%～21.91%，其中位于2號染色體的CAMS-327標記對單果質量的貢獻率最高，為21.91%(表4)。

MLM方法共檢測到17個SSR標記與7個性狀顯著關聯(lián)(P< 0.05)，其中，4個SSR標記與4個性狀極顯著關聯(lián)(P< 0.01)。顯著關聯(lián)的位點中，各位點對表型變異的貢獻率為2.07%～7.24%，其中位于11號染色體的HpmsE132標記對單果質量的貢獻率最高，為7.24%(表4)。

兩種方法共檢測到5個位點與株高相關聯(lián)，分別位于2、4、6、7和8號染色體，貢獻率為2.09%～3.94%(GLM方法)和3.15%～3.22%(MLM方法)，其中，8號染色體TC7268S位點貢獻率最高，在GLM和MLM方法中均能檢測到。

有7個位點與始花節(jié)位相關聯(lián)，分別位于1、2、5、8和11號染色體，貢獻率為2.13%～7.69%(GLM方法)和2.31%～3.39%(MLM方法)，其中，8號染色體的TC7268S位點貢獻率最高，TC7268S和CAMS-327位點用兩種方法均能檢測到。

有13個位點與單果質量相關聯(lián)，分別位于1、2、4、5、7、8、9和11號染色體，貢獻率為3.69%～21.91%(GLM方法)和2.29%～7.24%(MLM方法)，其中，2號染色體CAMS-327位點和11號染色體HpmsE132位點貢獻率最高，分別為21.91%和12.35%。CAMS-327、HpmsE132、CAMS-454、AF039662、Hpms1-69和Hpms1-155位點，在GLM和MLM方法中均能檢測到。

有12個位點與果縱徑相關聯(lián)，分別位于1、2、3、4、5、7、8 和11號染色體，貢獻率為2.40%～8.86%(GLM方法)和2.07%～5.29%(MLM方法)，其中，2號染色體ge35-141pmH0135C位點貢獻率最高。ge35-141pmH0135C、 HpmsE132和AF039662 位點在GLM和MLM方法中都能檢測到。

兩種方法共檢測到9個位點與果橫徑相關聯(lián)，分別位于2、4、5、6、8、9和11號染色體，貢獻率為3.65%～15.28%(GLM方法)和2.22%～5.13%(MLM方法)，其中，2號染色體CAMS-327位點和5號染色體CAMS-454位點貢獻率最高，分別為15.28%和11.71%。CAMS-327、CAMS-454、HpmsE132和Hpms2-24位點用兩種方法均能檢測到。

有6個位點與果形指數(shù)相關聯(lián)，分別位于4、5、6、7、9和11號染色體，貢獻率為2.33%～3.72%(GLM方法)和2.13%～3.44%(MLM方法)，其中，11號染色體CAMS-844位點和5號染色體CAMS-454位點貢獻率最高。CAMS-844、CAMS-454、Hpms2-24、CAMS-173和CAMS-378位點用兩種方法均能檢測到。

有8個位點與果肉厚度相關聯(lián)，分別位于2、7、8、9和11號染色體，貢獻率為3.78%～20.48%(GLM方法)和2.18%～6.63%(MLM方法)，其中，2號染色體CAMS-327位點貢獻率最高，達20.48%。CAMS-327、HpmsE132和Hpms2-24位點用兩種方法均能檢測到。

由表5可知，兩種方法共檢測到24個SSR關聯(lián)位點，除10、12號染色體外，其他10條染色體上均有分布，每個標記關聯(lián)性狀數(shù)量1～6個不等。

2.4 優(yōu)異等位變異及其載體材料

利用檢測到的主效QTL信息，可計算其等位基因的效應值。表型效應值為正值的，為增效等位變異，反之為減效等位變異，攜帶這些等位變異的種質即為相應載體材料。在7個農藝性狀中，GLM方法檢測到的既有增效等位變異，也有減效等位變異；MLM方法未檢測到株高、始花節(jié)位的增效等位變異以及果肉厚度的減效等位變異(圖2)。

GLM和MLM兩種方法共同檢測到的增/減效等位變異及其載體材料列于表6，可根據(jù)育種要求選擇合適位點及相應優(yōu)異等位變異。增/減效等位變異共12個，即AF039662b、CAMS-173b、CAMS-327a、CAMS-378b、CAMS-454c、CAMS-844b、ge35-141pmH0135Ca、Hpms1-155a、Hpms1-69a、Hpms2-24a、HpmsE132a和TC7268Sa，相應典型載體材料有B003、B010、B015、B020、B022、B042、B048、B052、B097、B111、B134、B138、B166、B178、B351、B352、C005、C014、V06C007、V06C0285、V06C1082、V06C1187、V06C1321、V06C1600、V06C1707、V06C1717、V06C1838和V06C1898等28個，這些都是辣椒7個農藝性狀的優(yōu)良載體材料。

表4 與辣椒農藝性狀顯著相關的標記位點及對表型變異的貢獻率Table 4 Marker loci associated with pepper agronomic traits and their contribution rate

表4(續(xù))

表5 SSR標記與關聯(lián)性狀數(shù)量Table 5 SSR Markers and the No. of associated agronomic traits

表6 GLM和MLM方法共同關聯(lián)到的12個顯著性位點的增/減效等位變異及其表型效應和相應載體材料Table 6 Twelve positive/negative alleles at loci significantly associated with pepper agronomic traits by both GLM and MLM methods and their allelic effect and corresponding carrier materials

圖2 與辣椒7個農藝性狀顯著關聯(lián)位點的等位變異表型效應Fig.2 Phenotypic effects of major alleles significantly associated with 7 agronomic traits of pepper

3 討論

本研究利用GLM和MLM兩種方法，共檢測到24個SSR關聯(lián)位點，分布于辣椒1、2、3、4、5、6、7、8、9、11號染色體上。兩種方法各有優(yōu)缺點，MLM因同時考慮群體結構Q和親緣關系K的影響，校正更嚴格，能更有效減少假陽性結果，但也可能因此而遺漏一些QTL位點。如本研究GLM檢出的株高關聯(lián)位點CAMS-327、始花節(jié)位關聯(lián)位點Hpms1-106、單果質量關聯(lián)位點ge35-141pmH0135C和果縱徑關聯(lián)位點CAMS-327等在前人基于家系的連鎖分析中也均被檢出[2,10-11,22]，但本研究MLM方法未能檢測到；GLM具有較高的統(tǒng)計效率，但由于較寬松的校正條件，可能會產生假陽性結果[23]。因此，本研究同時運用GLM和MLM兩種方法，可以互相驗證與補充，獲得的研究結果更準確全面。

本研究發(fā)現(xiàn)，不少位點與多個性狀關聯(lián)，且相關性顯著的性狀往往存在共同的關聯(lián)位點。如2號染色體的CAMS-327和8號染色體的TC7268S分別與6個性狀關聯(lián)；11號染色體的HpmsE132與5個性狀關聯(lián)；2號染色體的Hpms1-106、ge35-141pmH0135C，7號染色體的CO911525S，9號染色體的Hpms2-24，以及11號染色體的CAMS-844分別與4個性狀關聯(lián)；4號染色體的Hpms1-69和5號染色體的CAMS-454分別與3個性狀相關聯(lián)。這說明上述位點可能與多個功能基因存在連鎖關系，或其附近存在“一因多效”的基因[24-26]。這些與多個性狀關聯(lián)或連鎖的SSR位點，經進一步驗證后，可望應用于多個目標性狀的分子標記輔助選擇與聚合育種[27]。

研究表明，關聯(lián)分析檢測到的位點，有相當一部分與連鎖作圖定位的QTLs在同一基因組區(qū)域[28-30]。經比較，本研究發(fā)現(xiàn)的部分關聯(lián)位點與已報道的一些QTL位點位置相同或相近。例如，本研究與株高顯著關聯(lián)的8號染色體TC7268S位點、6號染色體CMAS-361位點和2號染色體CAMS-327位點分別與株高QTLs位點PH-8.2[10]、PH13.1[11]、PH-2[10]和PH14.1[11]位置相近或相同；2號染色體的始花節(jié)位關聯(lián)位點Hpms1-106與Tan等[22]檢測到的QTL位點Nle2.1位置相同，2號染色體的另一個始花節(jié)位關聯(lián)位點CAMS-327在不同的研究中均有報道[11, 22, 31-33]，說明這是一個調控辣椒始花節(jié)位的重要位點；單果質量CAMS-327位點與前人報道的fw21.1位點相同[32]，與FW-2.2位點位置相近[10]；果縱徑關聯(lián)位點CAMS-327、PM22、CAMS-075和pmc0491C分別與果縱徑QTLspaufl2.2[2]、FL-3.1[10]、Qfl.iivr.3.2[9]和FL-3.5[10]的位置相近，TC7268S位點與Dwivedi等[9]檢測到的Qfl.iivr.3.2位置一致；果橫徑HpmsE132位點與FD-11位置相近[10]；果形指數(shù)關聯(lián)位點CAMS-844和CAMS-065分別與果形2017和果形2016位點相近[31]；果肉厚度關聯(lián)位點CAMS-327與QTLPT14.1[11]位置一致。本研究還檢測到一些鮮見報道的關聯(lián)位點，可見基于自然群體的關聯(lián)分析與基于家系群體的連鎖作圖分析結果，可以相互驗證和補充[34]，有助于關聯(lián)位點或QTLs的高效精準鑒定。

本研究解析了辣椒7個農藝性狀關聯(lián)位點，發(fā)掘出與株高、始花節(jié)位、單果質量、果縱徑、果橫徑、果形指數(shù)和果肉厚度關聯(lián)的優(yōu)異等位變異，如TC7268Sa、CAMS-327a、HpmsE132a、ge35-141pmH0135Ca、CAMS-454c和Hpms2-24a等，篩選出B003、B020、B042、B048、B052和V06C1707等優(yōu)良載體材料。本研究發(fā)掘的優(yōu)良載體材料，既可作為7個農藝性狀遺傳分析的親本材料，也可直接用于辣椒品種改良，如育種目標為果大肉厚的豐產型雜交品種時，可選擇攜帶CAMS-327a、HpmsE132a和Hpms1-155a三個果重增效優(yōu)異等位變異的B048、B052和V06C1898作親本；育種目標為早熟辣椒雜交品種時，同時攜帶TC7268Sa和CAMS-327a兩個始花節(jié)位減效優(yōu)異等位變異的B003、V06C0007和V06C1321是理想親本材料。本研究所指優(yōu)異等位變異要根據(jù)特定育種目標而定，如選育早熟辣椒雜交品種時，始花節(jié)位減效等位變異為優(yōu)異等位變異，選育晚熟辣椒雜交品種時，始花節(jié)位增效等位變異為優(yōu)異等位變異。在本研究中，一些貢獻率較低的位點可能是微效QTLs，也可能受分子標記數(shù)量所限，分子標記與目標基因較遠，導致低估目標基因的貢獻率，后期可通過在目標區(qū)域增加標記密度進行深入挖掘。

4 結論

本研究基于194份辣椒核心種質表型數(shù)據(jù)和58個SSR標記基因型數(shù)據(jù)，通過關聯(lián)分析鑒定7個農藝性狀關聯(lián)位點。GLM和MLM方法分別檢測到20個和17個SSR關聯(lián)位點，這些位點與連鎖作圖定位的QTLs可互相驗證和補充。其中，有12個位點被兩種方法同時檢測到，基于其表型效應發(fā)掘出一系列優(yōu)異等位變異和優(yōu)良農藝性狀載體材料，后期可在目標區(qū)域增加標記密度以提高定位精度。本研究結果對辣椒相關農藝性狀的優(yōu)異基因發(fā)掘、分子標記輔助選擇與聚合育種具有重要的指導意義。