時丕彪 洪立洲 王 軍 費月躍 王偉義 呂遠大 顧閩峰,*

(1鹽城市新洋農業(yè)試驗站，江蘇 鹽城 224049； 2江蘇省農業(yè)科學院種質資源與生物技術研究所，江蘇 南京 210014)

土壤鹽漬化是限制農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一，已成為嚴重的世界性環(huán)境問題[1-2]。目前，全球有8億多公頃的土地受鹽分的不利影響，嚴重危害了植物的生長發(fā)育[3-4]，其通過破壞細胞內離子穩(wěn)態(tài)而導致細胞膜功能紊亂和代謝活動減弱，進而抑制細胞生長和誘導細胞死亡。鹽漬土中主要的陽離子是Na+，因此在鹽土環(huán)境中，植物必須將胞質Na+濃度降到最低才能承受鹽脅迫[5]。在長期的進化過程中，植物形成了三種不同的機制來阻止和適應高濃度的Na+在細胞質中的積累：1) 活性Na+的外排；2) 液泡內Na+的區(qū)隔化；3) 限制Na+內流[6]。各種離子轉運蛋白基因參與了以上生物學過程，其中Na+/H+逆向轉運蛋白基因是較為重要的一類基因，在維持植物離子穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。目前，主要包括兩類Na+/H+逆向轉運蛋白，即Na+/H+逆向轉運蛋白(salt overly sensitive 1,SOS1)和NHX1(Na+/H+逆向轉運蛋白1)[7]，它們能將胞質中的離子保持在適當濃度，從而使細胞毒性最小化。NHX1位于液泡膜，通過把細胞內的Na+泵入液泡而降低細胞內Na+濃度[8-9]；SOS1位于質膜，能將細胞質內的Na+外排出細胞，也對Na+從根系到地上部的長距離運輸十分有利[10]。

目前在很多植物中都發(fā)現(xiàn)了SOS1基因，其中，擬南芥AtSOS1基因首次報道[11-12]。當AtSOS1基因被敲除或突變失活時，擬南芥表現(xiàn)出對鹽脅迫極為敏感的表型[13-14]。該基因編碼的AtSOS1蛋白異常巨大，比擬南芥基因組中包含的其他陽離子/質子逆向轉運蛋白都要大，這是因為其C端區(qū)域占整個編碼區(qū)域的60%以上[15]。SOS1蛋白參與純化的質膜囊泡中Na+/H+的交換活動，說明SOS1對植物細胞Na+和K+的平衡具有重要作用[16]。相關研究表明，過表達SOS1可提高轉基因擬南芥和煙草的耐鹽性[17-19]；鹽脅迫能增加小麥TaSOS1的轉錄豐度[20]，誘導水稻OsSOS1基因mRNA的積累[21]，并引起擬南芥AtSOS1轉錄水平的上調[14]；不同植物SOS1基因的異源表達會抑制酵母突變體AXT3K的Na+敏感性，如擬南芥[22]、海神草[23]、番茄[24]等。此外，Ma等[25]對旱生植物霸王的研究表明，SOS1還控制著Na+和K+的長距離運輸和空間分布，維持著霸王體內Na+和K+的穩(wěn)態(tài)。但關于印度南瓜(CucurbitamaximaL.)SOS1基因的研究尚鮮見報道。

印度南瓜起源于南美洲，為葫蘆科南瓜屬一年生草本植物，富含類胡蘿卜素、糖分、礦物質和維生素等營養(yǎng)物質，是南瓜屬最重要的經(jīng)濟作物之一[26-27]。印度南瓜根系發(fā)達、抗逆性強，常被用作黃瓜、西瓜和甜瓜等的砧木，以增強其對土傳病害和非生物脅迫的耐受性[28]。然而，目前對印度南瓜耐鹽機制認識還比較薄弱，故挖掘耐鹽基因和了解相關耐鹽機制對培育耐鹽印度南瓜品種具有重要意義。本研究通過對印度南瓜轉錄組測序數(shù)據(jù)進行分析，克隆獲得印度南瓜SOS1基因cDNA全長序列，基于生物信息學方法初步分析該基因及其編碼蛋白的結構特征，并利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR， RT-qPCR)技術分析CmaSOS1基因在鹽脅迫和干旱脅迫下的表達模式，以期為進一步揭示CmaSOS1在非生物脅迫下的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和處理

印度南瓜材料由浙江大學蔬菜所提供。將印度南瓜種子殺菌消毒后于發(fā)芽盒進行催芽，待胚根突破種皮2～3 cm時進行水培處理。三葉一心期挑選長勢一致的幼苗，并分別用200 mmol·L-1NaCl溶液和20%聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG 6000)溶液進行鹽脅迫和干旱脅迫處理，分別處理0、2、4、6、12、24 h后取根部組織，液氮速凍后保存于-80℃冰箱用以RNA提取。每個處理設3次生物學重復，以處理0 h的樣品為對照。

1.2 印度南瓜總RNA提取及cDNA合成

用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取各組織及材料樣品總RNA?；蚩寺『捅磉_分析所用cDNA模板分別按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒(美國Thermo Scientific公司)和PrimeScriptTMRT-PCRKit反轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司)說明書合成。

1.3 CmaSOS1基因的克隆

對印度南瓜轉錄組測序數(shù)據(jù)進行分析，根據(jù)UniGene功能注釋結果獲得一條CmaSOS1全長序列，并設計基因特異性引物，正向引物F：5′-TTAATCAAATCTATAATAAATGTCCTTATTCG-3′，反向引物R：5′-GACATTTAGAATAAACTTTTGGAATACGAC-3′，以印度南瓜葉片cDNA為模板進行PCR擴增。擴增體系總體積50μL，包含10×LATaqPCRbuffer5μL、dNTPmix8μL、cDNA模板2μL、正反向引物各1μL、LATaq酶0.5μL以及ddH2O32.5μL。PCR反應程序：94℃預變性3min；98℃變性10s，55℃退火30s，65℃延伸3min20s，共30個循環(huán)；65℃延伸10min。PCR產物經(jīng)膠回收純化后，連接到pMD18-T載體上，再轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。菌液PCR驗證為陽性單菌落的菌液送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.4 CmaSOS1基因序列的生物信息學分析

利用ORFfinder分析CmaSOS1基因的開放閱讀框架并翻譯成氨基酸；在ExPASyProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)上預測CmaSOS1蛋白的分子質量和理論等電點；利用NCBI上的CDD分析CmaSOS1蛋白的保守結構域；分別在GORIV(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)上預測蛋白的二級結構和三級結構；CmaSOS1蛋白的親疏水性分析采用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在線軟件；利用TMHMMServerv.2.0和SignalP-5.0分別進行跨膜結構和信號肽分析；亞細胞定位預測采用PSORT軟件。利用ClustalX2.0軟件對CmaSOS1及NCBI上下載的其他物種同源SOS1蛋白的氨基酸序列進行多重比對；使用MEGA5.05軟件，采用鄰接法(bootstrap=1000)構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 CmaSOS1基因的實時熒光定量PCR表達分析

根據(jù)CmaSOS1基因的序列設計定量PCR引物進行表達分析，CmaSOS1-Fq：5′-CTGCTGAGATGAACAAAAGGTC-3′和CmaSOS1-Rq：5′-TGTGCAGTAGTACTTGGTGGTCTC-3′；內參基因CmaEF1a[29]的引物為CmaEF1a-F：5′-CTGCGAGGCACCAGAGTTCC-3′和CmaEF1a-R：5′-CCCAATCGATGGTGTGTGCCA-3′。PCR反應體系為20μL，包含10μLSYBRgreensupermix(Roche)、5.5μLddH2O、正反向引物各1μL和2.5μLcDNA。反應條件：95℃預變性10min；95℃變性10s，60℃退火30s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算相對表達量。

2 結果與分析

2.1 CmaSOS1基因全長cDNA序列的獲得

以印度南瓜葉片cDNA為模板，利用特異性引物進行RT-PCR擴增，產物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳獲得單一條帶(圖1)，測序后獲得印度南瓜Na+/H+逆向轉運蛋白基因全長cDNA序列，命名為CmaSOS1，GenBank登錄號為NW_019272028。該基因cDNA片段全長3 940 bp，包含一個3 429 bp的開放閱讀框架，編碼1 142 個氨基酸；5′非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTR)長161 bp，3′-UTR長350 bp(圖2)。

注：M：DNA marker 5 000 bp；1：RT-PCR產物。Note：M：DNA marker 5 000 bp. 1：RT-PCR product.圖1 CmaSOS1基因的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of CmaSOS1 gene

2.2 CmaSOS1基因的生物信息學分析

2.2.1CmaSOS1基因的結構 以CmaSOS1的cDNA序列為檢索對象，在NCBI BLAST上進行比對，得到與之相對應的DNA序列。將CmaSOS1基因的cDNA序列與DNA序列進行比對后發(fā)現(xiàn)，在基因組水平上，CmaSOS1基因長度較大，全長46 314 bp，含有23個外顯子、22個內含子、5′-UTR和3′-UTR(圖3)。

2.2.2 CmaSOS1蛋白的理化性質 利用ExPASy ProtParam分析CmaSOS1蛋白的理化性質，結果表明其分子式為C5714H9000N1510O1656S42，原子總數(shù)17 922，分子量為126.7 kDa，含有1 142個氨基酸。CmaSOS1蛋白的理論等電點為5.92，含有帶負電荷殘基(Asp + Glu) 120個，帶正電荷殘基(Arg + Lys) 101個，脂肪系數(shù)為101.50，蛋白質三維結構不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)為39.08，小于40，表現(xiàn)為穩(wěn)定狀態(tài)。綜上，推測CmaSOS1為酸性穩(wěn)定蛋白。

2.2.3 CmaSOS1蛋白的二級結構和三級結構預測 二級結構預測結果如圖4-A所示，該蛋白主要有α-螺旋、無規(guī)卷曲和延伸鏈，無β-折疊。其中，無規(guī)卷曲所占比例最高為44.92%，其次是α-螺旋占39.23%，延伸鏈所占比例最少為15.85%。

利用SWISS-MODEL在線分析CmaSOS1蛋白的三級結構，結果表明，該蛋白的空間結構以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，含有少量延伸鏈，與二級結構預測結果基本一致(圖4-B)。

2.2.4 CmaSOS1蛋白的親水性/疏水性分析 根據(jù)ProtScale工具預測，CmaSOS1的N末端有一個很強的疏水性結構，在第61位具有最高分值，為3.356，疏水性最強；而C末端有一個很強的親水性結構，在第1 016 位具有最低分值，為-3.133，親水性最強。該蛋白的親水系數(shù)為0.079，該數(shù)值大于零，推測CmaSOS1為疏水蛋白。

2.2.5 CmaSOS1蛋白跨膜結構分析 跨膜結構預測結果表明，CmaSOS1屬于典型的跨膜蛋白，具有12個跨膜結構域，這與已報道的其他植物[1,14]Na+/H+逆向轉運蛋白的跨膜結構域數(shù)目(10～12)一致。同時，用SignalP-5.0預測CmaSOS1信號肽的可能性值為0.000 3， 小于0.5，因此該蛋白不存在信號肽，屬于非分泌蛋白。

2.2.6 CmaSOS1的亞細胞定位預測 根據(jù)PSORT預測，CmaSOS1最可能被定位于質膜(80.0%)，其次是葉綠體類囊體膜(50.8%)和高爾基體(40.0%)，再次是內質網(wǎng)(30.0%)。

圖2 CmaSOS1基因cDNA序列及其推測的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence of CmaSOS1 gene and its deduced amino acid sequence

圖3 CmaSOS1基因的結構Fig.3 Gene structure of CmaSOS1

圖4 CmaSOS1蛋白的二級結構(A)和三級結構(B)預測Fig.4 Predicted secondary structure (A) and tertiary structure (B) of CmaSOS1 protein

2.2.7 CmaSOS1蛋白的保守結構域預測 保守結構域預測結果如圖5所示，CmaSOS1蛋白含有NhaP (Na+/H+or K+/H+antiporter) domain、Na_H_Exchanger superfamily和CAP_ED (catabolite gene activator protein-effector domain) superfamily等保守性區(qū)域，還含有一個配體結合位點(ligand binding site)和一個靈活的鉸鏈區(qū)域(flexible hinge region)。

圖5 CmaSOS1蛋白的保守結構域Fig.5 Conserved domains of CmaSOS1 protein

2.2.8 CmaSOS1蛋白的同源性與系統(tǒng)進化關系分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫通過BLASTP下載中國南瓜CmoSOS1 (Cucurbitamoschata，XP_022955949.1)、西葫蘆CpeSOS1 (Cucurbitapepo，XP_023525783.1)、甜瓜CmeSOS1 (Cucumismelo，XP_008466844.1)、黃瓜CsaSOS1 (Cucumissativus，KGN49745.1)、苦瓜McSOS1 (Momordicacharantia，XP_022146360.1)、月季RcSOS1 (Rosachinensis，XP_024192426.1)、毛果楊PtSOS1 (Populustrichocarpa，XP_024466547.1)、葡萄VvSOS1 (Vitisvinifera，CBI26761.3)、荷花NnSOS1 (Nelumbonucifera，XP_010276296.1)、棗ZjSOS1 (Ziziphusjujuba，XP_015894007.1)、海濱錦葵KpSOS1 (Kosteletzkyapentacarpos，AIS92905.1)和陸地棉GhSOS1 (Gossypiumhirsutum，NP_001313957.1)的氨基酸序列進行同源性比對，結果顯示，上述物種與印度南瓜CmaSOS1氨基酸序列一致性分別為98%、98%、90%、89%、89%、74%、75%、75%、72%、71%、70%和70%(圖6)，均表現(xiàn)出較高的同源性。

由圖7可知，同屬葫蘆科植物的印度南瓜、中國南瓜、西葫蘆、甜瓜、黃瓜和苦瓜的SOS1蛋白處于同一分支，具有較高的同源性，其中，中國南瓜CmoSOS1和西葫蘆CpeSOS1與印度南瓜CmaSOS1的同源性最高，親緣關系最近。印度南瓜CmaSOS1與錦葵科的海濱錦葵KpSOS1和陸地棉GhSOS1的親緣關系較遠。

圖6 印度南瓜CmaSOS1與其他植物SOS1蛋白的氨基酸序列比對Fig.6 Amino acid sequence alignment of SOS1 proteins from Cucurbita maxima and other species

2.3 CmaSOS1基因的表達分析

2.3.1CmaSOS1在印度南瓜各組織中的表達 由圖8可知，CmaSOS1基因在印度南瓜各組織中均有表達，但具有明顯的組織表達特異性。其中，CmaSOS1基因在根和葉中的表達量相對較高，其次是花和果實，在莖中的相對表達量最低，約為根中相對表達量的0.18倍。

2.3.2CmaSOS1在非生物脅迫下的表達分析CmaSOS1在不同的脅迫處理下具有不同的表達模式。由圖9-A可知，在200 mmol·L-1NaCl脅迫下，該基因被誘導上調表達，在處理2 h達到最高峰，約為對照的1.2倍，在處理4 h時下降至對照的0.65倍，在處理6 h和12 h時基本保持穩(wěn)定，在處理24 h時其相對表達量最低，約為對照的0.15倍。在20% PEG 6000脅迫下，CmaSOS1基因同樣被誘導上調表達，在處理2 h時相對表達量達到最大值，約為對照的1.4倍，之后大幅下降，在處理6 h時達到最低值，約為對照的0.13倍，之后CmaSOS1相對表達量持續(xù)上升并在處理24 h時達到高峰，約為對照的1.3倍(圖9-B)。

3 討論

SOS1基因是植物耐鹽性的關鍵基因，它所編碼的Na+/H+逆向轉運蛋白SOS1在調控Na+運輸和維持細胞內穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，AtSOS1基因的過量表達能顯著增加擬南芥植株的耐鹽性[17]，而擬南芥AtSOS1缺失突變體大大提高了其對鹽脅迫的敏感性[11, 30]。為研究SOS1基因對耐鹽性的作用，已在地膚[1]、擬南芥[14]和鹽角草[31]等植物中克隆了該基因并對其作用機制進行了探討。本研究首次克隆獲得一條印度南瓜CmaSOS1基因，其編碼蛋白為疏水蛋白，在N末端具有一個很強的疏水性結構，C末端有一個很強的親水性結構，這與菊花[2]SOS1蛋白結構相似，且在擬南芥中此親水性結構參與對Na+信號的感知[14]，因此推測CmaSOS1蛋白C末端親水性結構可能對印度南瓜細胞內Na+濃度具有一定的調控作用。Tang等[32]發(fā)現(xiàn)白楊SOS1蛋白定位于液泡膜，在液泡膜上發(fā)揮Na+區(qū)隔化功能。而本研究結果顯示，印度南瓜CmaSOS1定位于質膜上，可能在調控Na+外排過程中發(fā)揮重要作用。印度南瓜CmaSOS1蛋白與中國南瓜、西葫蘆、甜瓜、黃瓜和苦瓜SOS1蛋白的同源性較高，分別為98%、98%、90%、89%和89%，說明親緣關系越近的物種，其SOS1蛋白同源性越高。

SOS1基因在植物響應非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，水稻[21]、鹽角草[31]、黃花草木樨[33]、胡楊[34]、海草[35]和苔蘚[36]等植物在響應鹽脅迫時其SOS1基因的表達量均顯著升高。Xu等[20]發(fā)現(xiàn)小麥TaSOS1受鹽脅迫誘導呈上調表達，而PEG 6000處理下無明顯變化；而甘蔗ScSOS1受NaCl和PEG誘導后均呈上調表達[37]。Shi等[14]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtSOS1的轉錄水平受鹽脅迫誘導而升高，但不受干旱脅迫、低溫脅迫和脫落酸(abscisic acid，ABA)處理的影響；而Song等[38]對大島野路菊的研究表明，其SOS1基因表達量不僅受鹽脅迫誘導而顯著增加，還受干旱、低溫和ABA處理的影響發(fā)生不同程度的變化。上述研究結果說明，不同物種SOS1基因在響應同一非生物脅迫時可能發(fā)揮著不同的功能。本研究結果表明，CmaSOS1基因具有明顯的組織表達特異性，在印度南瓜根中的表達量最高，其次是葉片，在其他組織中相對表達量相對較低。該研究結果與前人在擬南芥[14]、鹽角草[31]和星星草[39]中的研究結果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，高濃度NaCl和PEG 6000脅迫下，CmaSOS1基因均受到誘導而呈上調表達，且都在脅迫處理2 h時達到最高峰。由此推測，CmaSOS1基因可能在印度南瓜抵御鹽分脅迫和干旱脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，但關于其功能驗證及調控機理仍需要進一步深入研究。

圖7 不同物種SOS1蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of SOS1 proteins from different species

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters mean significant differences at 0.05 level. The same as following.圖8 CmaSOS1基因在印度南瓜不同組織中的表達Fig.8 Expression level of CmaSOS1 in different tissues of Cucurbita maxima

4 結論

本研究結果表明，印度南瓜CmaSOS1基因cDNA全長3 940 bp，包含一個3 429 bp的開放閱讀框架，編碼1 142個氨基酸。預測其編碼蛋白CmaSOS1為酸性穩(wěn)定疏水性非分泌蛋白，屬于質膜型Na+/H+逆向轉運蛋白家族，且SOS1蛋白在葫蘆科植物中具有高度同源性。同時，CmaSOS1基因具有明顯的組織表達特異性，在根中相對表達量最高，還可能在印度南瓜抵御鹽分脅迫和干旱脅迫過程中發(fā)揮重要作用。后期的研究仍需利用轉基因技術或RNA干擾技術對其功能做進一步驗證。

圖9 鹽脅迫(A)和干旱脅迫(B)下CmaSOS1基因的表達分析Fig.9 Expression level of CmaSOS1 under salt stress (A) and drought stress (B)