譚婷婷 范元芳 李盛藍(lán) 王仲林 楊 峰 楊文鈺

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/四川省作物帶狀復(fù)合種植工程技術(shù)研究中心，四川 成都 611130)

大豆是我國(guó)重要的植物油和植物蛋白來源[1]，隨著生活水平提升，人們對(duì)大豆的需求量日漸增加[2]。近十年來，我國(guó)大豆進(jìn)口量遠(yuǎn)高于出口量[3]，2018年我國(guó)大豆進(jìn)口量約8 800萬 t[4]，但大豆年產(chǎn)量?jī)H約為1 300 萬 t[5]，進(jìn)口依存度大。間套作種植是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)集約化、提高土地當(dāng)量比的重要農(nóng)藝措施[6-7]，玉米大豆間套作是禾本科和豆科間套作模式之一[8]。玉米大豆帶狀套作是西南地區(qū)主推的種植模式，可在增加大豆種植面積的同時(shí)不影響玉米產(chǎn)量，對(duì)保障區(qū)域和國(guó)家糧食安全起到了重要作用[9-11]。在玉米大豆帶狀套作種植中，大豆?fàn)I養(yǎng)生長(zhǎng)期易受到玉米蔭蔽而導(dǎo)致后期產(chǎn)量顯著降低[12]，而提升光合作用是提高大豆產(chǎn)量的生理基礎(chǔ)[13]。

葉片光合作用過程中葉綠體負(fù)責(zé)光能的吸收、傳遞、轉(zhuǎn)化和電子傳遞等[14-16]，而葉片和葉綠體的結(jié)構(gòu)特征直接影響植物的光合能力[17-18]。在玉米大豆帶狀套作系統(tǒng)下，大豆葉片的葉面積、葉綠素含量和非光化學(xué)熒光猝滅系數(shù)(non-photochemical quenching，NPQ)增加[19-20]，而葉片碳氮比、葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉片光系統(tǒng)Ⅱ的潛在活性(potential activity of PSⅡ，F(xiàn)v/Fo)降低[21-22]。前人主要圍繞大豆農(nóng)藝性狀、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和葉肉組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，對(duì)蔭蔽下大豆葉片柵欄組織內(nèi)葉綠體結(jié)構(gòu)變化的研究較少，且前人研究多圍繞葉綠體大小、基粒數(shù)量、淀粉粒大小等指標(biāo)，而探討不同品種葉片葉綠體結(jié)構(gòu)和光合熒光對(duì)不同蔭蔽程度響應(yīng)的較少[23-25]。因此，本研究在前人研究基礎(chǔ)上，深入分析了不同品種葉片葉綠體結(jié)構(gòu)特征、基粒面積以及淀粉粒面積和葉綠體面積的比例關(guān)系對(duì)蔭蔽的響應(yīng)，揭示不同品種葉片結(jié)構(gòu)特征與光合熒光特性對(duì)不同蔭蔽程度的響應(yīng)差異，旨在為耐蔭性大豆品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試玉米(ZeamaysL.)品種選用川單418(春播生育期109 d左右[26]，株型半緊湊，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所提供)；供試大豆[Glycinemaxl(L.) Merr]品種選用南豆12(四川省主推品種[27]，光不敏感型[28]，夏播生育期127 d左右[29]，株型收斂，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供)和桂夏3號(hào)(適合玉米套作[30]，光敏感型[31]，夏播生育期115 d左右[32]，株型收斂，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)進(jìn)行，采用盆栽試驗(yàn)，模擬大田玉米大豆套作種植，供試土壤為有機(jī)質(zhì)與大田土(紫色土，pH值6.99，有機(jī)質(zhì)含量1.19%)按2∶1比例混合。大豆設(shè)置3個(gè)處理：大豆單作(CK)，單行玉米間套作大豆(A1；玉米行距100 cm，大豆放置在玉米行間，大豆行與玉米行間距為50 cm)和兩行玉米帶間套作大豆(A2；玉米窄行40 cm，寬行160 cm，兩行大豆放置在玉米寬行內(nèi)，大豆行與玉米行間距為70 cm)。玉米于3月18日育苗，4月1日移栽，定植于直徑30 cm、高25 cm的花盆中，每盆1株，每行12盆，8月3日收獲。大豆于5月25日播種于長(zhǎng)50 cm、寬20 cm、高15 cm的花盆中，每盆1行4株，株距10 cm，每個(gè)處理種植10盆。期間對(duì)盆栽玉米大豆進(jìn)行科學(xué)的水肥管理。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 大豆冠層光量子通量密度 于大豆V5時(shí)期(大豆第5片復(fù)葉全展，玉米進(jìn)入灌漿期)，在晴天9:00-17:00每間隔2 h對(duì)大豆冠層光量子通量密度(photosynthetic photon flux density，PPFD)的日變化進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定時(shí)，將HR-350手持式光譜計(jì)(中國(guó)臺(tái)灣Hi-Point公司)放在大豆冠層頂部上方10 cm處，由西向東依次測(cè)定5個(gè)點(diǎn)[33]，取平均值作為大豆冠層的光環(huán)境數(shù)據(jù)。

1.3.2 大豆葉片光合參數(shù) 于大豆V5時(shí)期，采用Li-6400XT光合儀(美國(guó)Li-Cor公司)在晴天11:00測(cè)定大豆葉片的凈光合速率(net photosynthesis rate，Pn)、蒸騰速率(transpiration rate，Tr)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，Gs)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)。設(shè)定PPFD恒定為1 000 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為450 μmol·mol-1，溫度為25℃[34]。測(cè)定時(shí)，選擇大豆植株倒三復(fù)葉(從上往下數(shù)第3片全展復(fù)葉)的中間葉片進(jìn)行測(cè)定。各處理選擇3株具有代表性的大豆植株進(jìn)行測(cè)定，取平均值。

1.3.3 大豆葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù) 于大豆V5時(shí)期，采用CF Image葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)(英國(guó)Technologica公司)測(cè)定大豆葉片PSⅡ的潛在活性(Fv/Fo)、PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率(maximal PSⅡ quantum yield in the dark，F(xiàn)v/Fm)、非光化學(xué)熒光猝滅系數(shù)(NPQ)、PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量(photochemical efficiency of PSⅡ in the light，F(xiàn)v′/Fm′)、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(actual light quantum yield of PSⅡ，F(xiàn)′q/F′m)。

Fv/Fo=(Fm-Fo)/Fo

(1)

式中，F(xiàn)m指最大熒光，F(xiàn)o指最小初始熒光。各處理選擇3株具有代表性的大豆植株進(jìn)行測(cè)定，取平均值。

1.3.4 大豆葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu) 于大豆V5時(shí)期，在大豆倒三復(fù)葉中間葉片靠近主葉脈基部的1/3處取樣(0.5 cm×1 cm)，先用3%戊二醛進(jìn)行預(yù)固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級(jí)脫水，再用Epon812環(huán)氧樹脂(美國(guó)Sigma公司)包埋，半薄切片光學(xué)定位，超薄切片，然后用醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，最后用H-600IV型透射電鏡(日本Hitachi公司)觀察拍照[36]。各處理選擇3株具有代表性的大豆植株，采用Image J軟件測(cè)定葉綠體內(nèi)基粒數(shù)量、葉綠體內(nèi)基粒厚度、基粒面積、淀粉粒面積和葉綠體面積。

1.3.5 大豆葉片解剖結(jié)構(gòu) 于大豆V5時(shí)期，選取倒三復(fù)葉的中間葉片，在靠近主脈基部的1/3處取樣(0.5 cm×0.5 cm)。將剪下的材料快速放入標(biāo)準(zhǔn)固定液(formaldehyde-acetic acid-ethanol fixative，F(xiàn)AA)中固定保存，先用酒精和正丁醇系列脫水，石蠟包埋，隨后用Leica切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)切片，然后使用松節(jié)油和酒精系列脫蠟、復(fù)水后進(jìn)行番紅-固綠染色，最后用中性樹膠封片，做成石蠟切片。用Nikon eclipse 50i顯微鏡(日本Nikon公司)觀察并拍照[37]，用Image J軟件測(cè)量大豆葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度等參數(shù)。各處理選擇3株具有代表性的大豆植株進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用Origin Pro 2018軟件作圖，SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，并采用SSR法(shortest significant ranges)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆冠層光量子通量密度

由圖1可知，3個(gè)處理下兩品種大豆冠層PPFD在一天內(nèi)均呈先增加后降低的變化趨勢(shì)。A1、A2的PPFD顯著低于CK，其中，A1、A2在13:00的PPFD分別較CK顯著降低82.99%和72.64%。這些結(jié)果與套作大豆行與玉米行之間的距離(A1和A2的玉米行和大豆行間距分別為50和70 cm)及玉米的行距(A1的玉米行距為100 cm，A2的玉米寬行行距為160 cm)有關(guān)。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level among treatments.圖1 不同處理下大豆冠層PPFDFig.1 Soybean canopy photosynthetic photon flux density under different treatments

表1 玉米蔭蔽對(duì)大豆葉片光合參數(shù)的影響Table 1 Effects of maize shading on photosynthetic parameters of soybean leaves

2.2 大豆葉片光合參數(shù)

由表1可知，蔭蔽下大豆葉片Pn、Gs、Tr顯著低于CK，但3個(gè)處理的Ci差異不顯著。在A1和A2條件下，兩品種大豆葉片Pn、Gs、Tr平均較CK分別降低44.32%和39.00%(A1和A2，下同)、43.33%和31.11%、42.46%和10.22%。同時(shí)，除桂夏3號(hào)的Pn外，兩大豆品種在A2的Pn、Gs、Tr顯著高于A1，且相同處理?xiàng)l件下，南豆12的Pn和Gs高于桂夏3號(hào)。

2.3 大豆葉片葉綠素?zé)晒?/h3>

由表2可知，蔭蔽下大豆葉片的Fv/Fo和Fv/Fm顯著高于CK，F(xiàn)q′/Fm′顯著低于CK，但3個(gè)處理的NPQ和Fv′/Fm′差異不顯著。兩品種在A1和A2的葉片F(xiàn)v/Fo和Fv/Fm平均較CK增加24.96%和22.34%、4.52%和3.87%，F(xiàn)q′/Fm′平均較CK降低8.93%和16.07%。此外，除桂夏3號(hào)在A1的Fq′/Fm′顯著高于A2外，兩品種在A1的Fv/Fo、Fv/Fm和Fq′/Fm′與A2差異均不顯著。相同處理?xiàng)l件下，南豆12葉片的Fv/Fo、Fv/Fm和Fq′/Fm′均高于桂夏3號(hào)。

2.4 大豆葉片解剖結(jié)構(gòu)

由圖2和表3可知，與CK相比，蔭蔽下大豆葉片厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度降低，海綿組織和柵欄組織排列稀疏。南豆12在A1和A2的葉片厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度較CK分別顯著降低38.09%和21.36%、45.24%和30.94%、54.04%和44.89%，桂夏3號(hào)在A1和A2的葉片厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度較CK分別顯著降低48.15%和32.04%、51.12%和38.75%、63.58%和58.79%。南豆12和桂夏3號(hào)在A1的上表皮厚度分別較CK顯著降低12.60%和14.39%，但南豆12和桂夏3號(hào)在A2的上表皮厚度與CK差異不顯著。此外，桂夏3號(hào)在A1的海綿組織厚度較CK顯著降低47.41%，但A2的海綿組織厚度與CK差異不顯著；南豆12在3個(gè)處理的海綿組織厚度差異均不顯著。兩大豆品種在A2的葉片厚度和下表皮厚度顯著高于A1。玉米蔭蔽下，南豆12的葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度均高于相同處理的桂夏3號(hào)。

表2 玉米蔭蔽對(duì)大豆葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Table 2 Effects of maize shading on chlorophyll fluorescence parameters of soybean leaves

注：A、B、C分別為南豆12在A1、A2、CK的葉片解剖結(jié)構(gòu)圖，D、E、F分別為桂夏3號(hào)在A1、A2、CK的葉片解剖結(jié)構(gòu)圖。Note: A, B, and C are the leaf anatomical structure of Nandou 12 under A1, A2, and CK, respectively. D, E, and F are the leaf anatomical structure of Guixia 3 under A1, A2, and CK, respectively.圖2 玉米蔭蔽對(duì)大豆葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of maize shading on anatomical structure of soybean leaves

2.5 大豆葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)

由圖3和表4可知，蔭蔽下，兩大豆品種葉綠體基粒厚度和基粒面積/葉綠體面積較CK顯著增加；桂夏3號(hào)淀粉粒面積和淀粉粒面積/葉綠體面積較CK顯著增加，南豆12在A1的淀粉粒面積和淀粉粒面積/葉綠體面積較CK顯著增加，但A2的淀粉粒面積和淀粉粒面積/葉綠體面積與CK差異不顯著；兩大豆品種基粒數(shù)量變化規(guī)律不同，蔭蔽下南豆12的基粒數(shù)量較CK增加，桂夏3號(hào)則較CK降低。此外，兩大豆品種在A1的基粒厚度、基粒面積/葉綠體面積、淀粉粒淀粉粒面積/葉綠體面積均顯著高于A2，且南豆12的基粒厚度、淀粉粒面積和淀粉粒面積/葉綠體面積均高于桂夏3號(hào)。

3 討論

光照強(qiáng)度影響大豆的生長(zhǎng)發(fā)育[22]。本研究中套作條件下玉米蔭蔽導(dǎo)致大豆冠層PPFD顯著降低，同時(shí)導(dǎo)致大豆葉片Pn、Gs和Tr顯著降低，這與程亞嬌等[38]使用遮陰網(wǎng)設(shè)置不同光強(qiáng)分析大豆光合特性的研究結(jié)果相似。許大全[39]研究表明，若葉片Pn降低的主要因素是氣孔部分關(guān)閉，則Ci降低；若Pn降低的主要因素是葉肉細(xì)胞光合活性降低，則Ci升高。在本研究中，隨著玉米蔭蔽程度增加，大豆葉片Pn、Gs和Tr降低，而Ci略有增加但差異不顯著，說明蔭蔽下大豆葉片Pn下降的主要因素不是氣孔限制。

表3 玉米蔭蔽對(duì)大豆葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effects of maize shading on anatomical structure of soybean leaves /μm

葉綠素?zé)晒饽芊从抄h(huán)境因子對(duì)植物光合作用的影響[40]。在本研究中，玉米蔭蔽下大豆葉片F(xiàn)v/Fo和Fv/Fm較CK顯著增加，但F′q/F′m顯著降低，與范元芳等[41]關(guān)于蔭蔽環(huán)境下大豆葉片F(xiàn)′v/F′m和F′q/F′m增加，F(xiàn)v/Fm和NPQ下降的研究結(jié)果不一致。蔭蔽導(dǎo)致大豆冠層PPFD降低，捕光復(fù)合體Ⅱ(light harvesting complex Ⅱ，LHCⅡ)捕獲的光能降低，進(jìn)而使PSⅡ可利用的光能降低。以上變化可能使電子載體質(zhì)體醌(plastoquinones，PQ)還原減少，導(dǎo)致PSⅡ至細(xì)胞色素b6f復(fù)合體(cytochrome b6f)的電子傳遞效率降低，而電子傳遞又推動(dòng)一系列光合反應(yīng)，因此大豆葉片實(shí)際光效率降低。但大豆葉片捕獲的光能降低，可能促使F′v/F′o和Fv/Fm增加，光能利用潛力增加。蔭蔽環(huán)境下南豆12葉片的Fv/Fo、Fv/Fm及Fq′/Fm′高于桂夏3號(hào)，NPQ低于桂夏3號(hào)，說明南豆12捕獲的光能用于光化學(xué)反應(yīng)的比例更高，能夠更好地通過增強(qiáng)光能捕獲效率來彌補(bǔ)弱光對(duì)自身發(fā)育的影響。

植物能通過調(diào)節(jié)光合器官的結(jié)構(gòu)來適應(yīng)不同光環(huán)境[42]。葉片作為光合作用的主要器官，蔭蔽環(huán)境下其形態(tài)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變[43-44]。本研究中，蔭蔽下大豆葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度均降低，柵欄組織和海綿組織排列稀疏。葉片厚度和柵欄組織厚度與葉片光合能力密切相關(guān)[45-47]，蔭蔽下南豆12的葉片厚度和柵欄組織厚度高于桂夏3號(hào)，說明南豆12在蔭蔽環(huán)境下柵欄組織更發(fā)達(dá)，有較好的葉片結(jié)構(gòu)來容納更多的葉綠體，降低蔭蔽對(duì)自身光合作用的影響。

葉綠體是高等植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，大豆葉片光合速率的改變必然與葉綠體緊密相關(guān)[48]。本研究中，蔭蔽導(dǎo)致大豆葉片葉綠體長(zhǎng)邊背向細(xì)胞壁凸起，變?yōu)椴灰?guī)則的橢圓形狀，葉綠體基粒厚度和基粒面積/葉綠體面積增加，說明大豆受蔭蔽脅迫后，葉綠體可能通過增加類囊體垛疊程度來增加光合膜面積，增加光合反應(yīng)場(chǎng)所，提高光能捕獲能力，促進(jìn)光能吸收傳遞、電子傳遞和ATP的產(chǎn)生。此外，玉米蔭蔽下可使葉綠體內(nèi)淀粉粒面積較CK顯著增加，這可能是因?yàn)槭a蔽使淀粉運(yùn)輸受阻，以淀粉粒形式儲(chǔ)存在葉綠體內(nèi)，導(dǎo)致淀粉粒面積增加，其具體機(jī)理還需通過試驗(yàn)進(jìn)一步研究。蔭蔽環(huán)境下大豆葉片葉綠體基粒數(shù)量變化在品種間表現(xiàn)不一致，南豆12的基粒數(shù)量較CK增加，桂夏3號(hào)則降低，且南豆12葉綠體的基粒厚度、淀粉粒面積及淀粉粒面積/葉綠體面積均高于桂夏3號(hào)，說明與桂夏3號(hào)相比，套作玉米蔭蔽下南豆12的類囊體垛疊程度和基?？偯娣e更高，捕光結(jié)構(gòu)更加密集，淀粉積累量更多，制造光合產(chǎn)物的能力更強(qiáng)。盆栽種植條件下，花盆將玉米和大豆的根系分隔開，不存在養(yǎng)分與水分等的競(jìng)爭(zhēng)[49]，這與大田種植存在一定的差異，故下步試驗(yàn)將探討大田種植下，玉米蔭蔽對(duì)大豆葉片的影響。

4 結(jié)論

套作玉米蔭蔽下大豆葉片葉綠體基粒垛疊程度增加，葉肉組織排列稀疏，Pn和F′q/F′m下降，隨著蔭蔽程度增加，大豆葉片葉綠體基粒厚度、基粒面積/葉綠體面積、淀粉粒面積和Fv/Fm增加，葉片厚度、柵欄組織厚度、Pn、Gs和Tr降低。蔭蔽下，南豆12的葉片葉綠體基粒厚度、基粒面積/葉綠體面積、柵欄組織厚度、Pn等均高于桂夏3號(hào)，說明與桂夏3號(hào)相比，蔭蔽環(huán)境下南豆12具有較好的葉綠體結(jié)構(gòu)和葉片結(jié)構(gòu)來提高捕光能力。