汪 藝 馮俊麗,2,* 戴志遠,2 田小蘭

(1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州 310012)

鱈魚屬脊椎動物門(Vertebrata)硬骨魚綱(Osteichthyes)鱈形目(Gadiformes)。鱈魚營養(yǎng)豐富、肉味鮮美，是全世界年捕撈量最大的魚類之一，具有重要的經(jīng)濟價值[1-2]。目前，我國市售鱈魚主要分為三類：第一類為鱈科鱈魚類，包括大西洋鱈魚(Gadusmorhua)、太平洋鱈魚(G.macrocephalus)、狹鱈(Theragrachalcogramma)、黑線鱈(Melanogrammusaeglefinus)、青鱈(Theragrachalcogramma)等；第二類被稱為“銀鱈魚”的裸蓋魚(Anoplopomafimbria)和南極犬牙魚(Dissostichuseleginoides)，其分別屬鲉形目和鱸形目，但營養(yǎng)價值高于鱈科鱈魚類[3]；第三類為魚目混珠的假鱈魚類，俗稱油魚，主要為棘鱗蛇鯖(Ruvettuspretiosus)和異鱗蛇鯖(Lepidocybiumflavobrunneum)，均屬于鱸形目。異鱗蛇鯖含有40%以上的蠟脂(蛇鯖毒素)，主要用于提煉工業(yè)潤滑劑，不可食用[4]。

為規(guī)范鱈魚類商品的標示，香港食品安全中心于2007年推出了《有關(guān)識別及標簽: 油魚/鱈魚的指引》[5]，指出鱈魚只代表鱈形目魚類，南極犬牙魚和裸蓋魚仍可使用俗名“銀鱈魚”。然而，鱈形目魚類品種繁多，形態(tài)學(xué)差異較小，不同的鱈魚品種市場價格差異懸殊，常出現(xiàn)以次充好、偽造摻假的現(xiàn)象[6-8]。近年，多個城市出現(xiàn)不法商販將異鱗蛇鯖冒充鱈魚賣，引起消費者腹瀉、腸胃痙攣等不適[8]。此外，約六成市售鱈魚是去頭去內(nèi)臟的冷凍形式，其余四成是去皮去骨的魚切片，消費者難以通過形態(tài)特征判斷魚的種類。因此，為了更加有效地確保鱈魚產(chǎn)品質(zhì)量，防止以次充好，需要一種快速有效的鱈魚物種鑒定方法。

與傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒別相比，基于DNA技術(shù)的分子生物學(xué)檢測法[9-13]更適合各種鱈魚產(chǎn)品(冷凍切片及深加工制品)的鑒別。DNA遺傳序列能精確的鑒定物種，尤其線粒體DNA具有較高的變異和進化速率，常被用于鑒定近緣物種。常用的線粒體片段有Cytb[14]基因、COI[15]基因和D-loop區(qū)域(也稱control region，CR)[16]等。

目前，聚合酶鏈式反應(yīng)(polynlerase clmin reaction，PCR)技術(shù)是應(yīng)用最為廣泛的物種鑒定分子生物學(xué)方法。在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)的應(yīng)用越來越廣泛。qPCR是在PCR體系中引入熒光信號，利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增反應(yīng)每一個循環(huán)PCR產(chǎn)物量的變化[17]。 其中，SYBR Green Ⅰ 法適用性較廣，不需要合成特異性探針，具有低成本、高特異性、高檢測效率等特點，常用于食品真?zhèn)舞b定。相比于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，qPCR的優(yōu)點是不需要在反應(yīng)結(jié)束后再開蓋進行電泳檢測，既降低了污染的可能性，也減少了操作時間。此外，有研究表明，水產(chǎn)品經(jīng)過熱加工，基因已經(jīng)大量降解為200 bp以下的小片段[18-20]。qPCR所擴增的片段較短(一般小于250 bp)，因此對冰凍和新鮮水產(chǎn)品，以及熟制或罐裝等鱈魚類產(chǎn)品均可進行物種鑒定。

本研究以鱈科大西洋鱈魚、太平洋鱈魚及黑線鱈為研究對象，陰性對照選擇俗稱“銀鱈魚”的南極犬牙魚和假鱈魚異鱗蛇鯖，利用線粒體16S rDNA和Cytb基因片段，建立qPCR體系，對其進行物種分析及鑒定，旨在探索建立鱈魚市場監(jiān)管的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大西洋鱈魚、太平洋鱈魚、黑線鱈和南極犬牙魚及異鱗蛇鯖均由浙江工商大學(xué)海洋食品研究院提供，-20℃冰箱冷凍保存。13種檢測樣品(其中包括6種深加工樣品)均購自杭州當?shù)囟嗵幨袌霾⒌蜏?4℃)保存。

磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)，自制；液氮，杭州今工氣體有限公司；Axygen基因組DNA小量提取試劑盒，吳江康寧生命科學(xué)有限公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(2×)試劑盒、PrimeSTAR Max Premix(2×) 試劑盒，大連TaKaRa生物公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HB-100型恒溫金屬浴，杭州博日科技有限公司；MRIEX-5型漩渦振蕩器，海門其林貝兒儀器制造有限公司；ChemDoc XRS型凝膠成像系統(tǒng)，T100型PCR儀、PTC-0148型Mini Opticon Monitor 3實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；BSAl24S-CW型電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；EVOLUTION 60S型紫外可見分光光度計、Fresco 21型高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific 公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 待測樣品DNA提取 分別稱取300 mg待測樣品，使用Axygen基因組DNA小量提取試劑盒提取基因組DNA。獲得的DNA經(jīng)1.5%凝膠電泳檢測后，通過紫外可見分光光度計在260 nm波長下測定其濃度。將大西洋鱈魚、太平洋鱈魚、黑線鱈、南極犬牙魚及異鱗蛇鯖DNA用無菌雙蒸水進行10倍連續(xù)梯度稀釋進行絕對靈敏度試驗。所有DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

混合DNA制備：將切碎的異鱗蛇鯖肉分別與3種鱈魚肉(大西洋鱈魚、太平洋鱈魚及黑線鱈)混合制得含10%、1%、0.1%、0.01%及0.001%(w/w)目標鱈魚肉的混合物，分別稱取300 mg，使用Axygen基因組DNA小量提取試劑盒提取基因組DNA。所有DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 qPCR引物設(shè)計 通過NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載鱈科中常見鱈魚、南極犬牙魚及異鱗蛇鯖的線粒體基因序列，如表1所示。經(jīng)DNAStar軟件里的MegAlign工具比對，找出各序列中的保守和變異區(qū)域。

表1 引物設(shè)計的GenBank序列號Table 1 GenBank accession numbers for sequences used to design primers

使用Primer Premier 5.0(PREMIER Biosoft International，Palo Alto，CA)軟件設(shè)計候選引物，并根據(jù)各引物的二聚體和錯配發(fā)生率進行篩選。所有特異性引物都經(jīng)過GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.Blast.cgi)工具測試以保證其特異性。最終選擇線粒體Cytb基因作為檢測3種目標鱈魚、南極犬牙魚及異鱗蛇鯖的標記基因；選擇16S rDNA 基因設(shè)計區(qū)分鱈科和非鱈科魚類的引物。所設(shè)計的qPCR引物如表2所示。所有引物序列均由上海生工生物有限公司合成。

表2 qPCR的引物Table 2 The primer sequences for quantitative real-time PCR

1.3.3 引物特異性檢測 在對3種鱈科鱈魚(大西洋鱈、太平洋鱈和黑線鱈)及2種非鱈科魚類(南極犬牙魚和異鱗蛇鯖)的引物特異性試驗中，目標鱈魚為試驗組，其他四種為陰性對照，以無菌雙蒸水為模板作空白對照，進行3個平行的qPCR試驗。在利用16S rDNA 基因區(qū)分鱈科和非鱈科魚類試驗中，上述3種鱈科鱈魚為試驗組，非鱈科品種(南極犬牙魚和異鱗蛇鯖)為陰性對照，以無菌雙蒸水為模板作空白對照，進行3個平行的qPCR試驗。

qPCR反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL TB GreenTMPremix Ex TaqTM反應(yīng)液、0.3 μL正向引物和反向引物(各10 μmol·L-1)、1.5 μL DNA模板、7.9 μL無菌雙蒸水。大西洋鱈魚，太平洋鱈魚特異性體系反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，61℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。南極犬牙魚的反應(yīng)條件與上述相同，僅退火溫度設(shè)定為55℃。此外，黑線鱈、異鱗蛇鯖的反應(yīng)體系及16S rDNA體系反應(yīng)條件也與上述相同，僅將退火溫度設(shè)定為58℃。

1.3.4 擴增效率與可靠性 單一魚肉樣品：將各測試魚類DNA進行10倍連續(xù)梯度稀釋，分別進行各濃度DNA樣品的qPCR試驗，每個濃度設(shè)置3個平行試驗。以目標鱈魚DNA濃度(ng·μL-1)對數(shù)值為橫坐標，該濃度對應(yīng)的平均循環(huán)閾值(Ct)為縱坐標，建立各體系的標準曲線。計算曲線的R2值，并根據(jù)曲線斜率(slope)得出反應(yīng)效率：E=[10(-1/slope)-1] ×100%，以此判斷每個體系的反應(yīng)效率和目標DNA 濃度檢測區(qū)間。

混合魚肉樣品：選取大西洋鱈魚、太平洋鱈魚和黑線鱈3種樣品，分別對含10%、1%、0.1%、0.01%及0.001%(w/w)目標鱈魚肉的混合魚肉樣品DNA進行各質(zhì)量分數(shù)的qPCR試驗，設(shè)置3個平行試驗。以質(zhì)量分數(shù)(%)對數(shù)值為橫坐標，該濃度對應(yīng)的平均循環(huán)閾值(Ct)為縱坐標，構(gòu)建各特異性體系的標準曲線。并根據(jù)曲線斜率(slope)得出反應(yīng)效率，以此判斷每個體系的反應(yīng)效率和相對濃度檢測區(qū)間。

1.3.5 市售鱈魚及鱈魚深加工制品的檢測 qPCR檢測：為驗證所建立qPCR體系的實際應(yīng)用性，從當?shù)厥袌鲑彽?3種鱈魚及鱈魚深加工制品，試驗重復(fù)3次。

常規(guī)PCR檢測：常規(guī)PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL PrimeSTAR Max Premix (2×)反應(yīng)液、0.5 μL正向引物和反向引物(同qPCR，各10 μmol·L-1)、1 μL DNA模板、8 μL無菌雙蒸水。常規(guī)PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA提取

通過紫外可見分光光度計在260 nm波長下測定分析，大西洋鱈魚DNA的濃度為380 ng·μL-1，太平洋鱈魚DNA的濃度為470 ng·μL-1，黑線鱈DNA的濃度為345 ng·μL-1，南極犬牙魚DNA的濃度為465 ng·μL-1， 異鱗蛇鯖DNA的濃度為435 ng·μL-1。

2.2 qPCR體系的優(yōu)化

通過調(diào)整反應(yīng)退火溫度和引物濃度來優(yōu)化qPCR體系，最終確定大西洋鱈魚、太平洋鱈魚特異性體系反應(yīng)的退火溫度為61℃；南極犬牙魚特異性體系反應(yīng)的退火溫度為55℃；黑線鱈、異鱗蛇鯖特異性反應(yīng)體系及16S rDNA體系反應(yīng)的退火溫度為58℃；qPCR體系正向引物和反向引物的濃度均為300 nmol·L-1時，能獲得較強的熒光信號和較低的檢出時間(Ct值)。

2.3 qPCR體系的特異性

通過測試目標物種與其他物種的擴增性能來評估各反應(yīng)體系的特異性。為區(qū)分非特異性擴增，將Ct值小于33的試驗結(jié)果判定為有效，即陽性擴增。由圖1可知，每個體系中對應(yīng)的目標基因都出現(xiàn)S型擴增曲線(陽性)，而非目標基因及空白對照在Ct值小于33時并未出現(xiàn)擴增反應(yīng)(陰性)，表明本研究設(shè)計的六組qPCR體系具有較強的特異性。

2.4 qPCR體系的標準曲線分析

針對單一魚肉樣品，將各測試魚類樣品DNA連續(xù)梯度稀釋后，分別對各濃度樣品進行qPCR反應(yīng)，并根據(jù)試驗結(jié)果評估各反應(yīng)體系的絕對靈敏度并構(gòu)建標準曲線。結(jié)果顯示，大西洋鱈魚、太平洋鱈魚和黑線鱈的16S rDNA體系標準曲線(圖2-A)斜率分別為-3.174、-3.584、-3.409，對應(yīng)的擴增效率最低90.11%，最高106.56%，曲線的R2值分別為0.999 6、0.998 3、0.999 0。 品種特異性擴增體系中，大西洋鱈魚、太平洋鱈魚、黑線鱈、異鱗蛇鯖和南極犬牙魚標準曲線(圖2-B)的斜率分別為-3.093、-3.399、-3.244、-3.464、 -3.259， 對應(yīng)的擴增效率分別為110.53%、96.88%、103.36%、102.69%、94.39%，R2值分別為0.991 2、0.999 2、0.999 9、0.999 1、0.997 9。

為了研究各反應(yīng)體系的相對靈敏度，對含0.001%～10%(w/w)目標鱈魚肉的混合魚肉樣品DNA分別進行各質(zhì)量分數(shù)樣品的qPCR試驗。結(jié)果顯示，16S rDNA體系中大西洋鱈魚、太平洋鱈魚和黑線鱈的標準曲線斜率分別為-3.262、-2.649、-2.697(圖2-C)，對應(yīng)的擴增效率最低102.56%，最高138.51%，曲線的R2值最低0.992 4，最高0.997 0。品種鑒定特異性擴增試驗體系中大西洋鱈魚、太平洋鱈魚和黑線鱈的標準曲線的斜率分別為-3.507、-2.954、-2.896(圖2-D)，對應(yīng)的擴增效率最低92.81%，最高121.46%，R2值最低0.991 8，最高0.999 6。

上述結(jié)果體現(xiàn)出單一樣品中模板濃度對數(shù)值以及混合樣品中質(zhì)量分數(shù)對數(shù)值與Ct值之間均存在良好的線性關(guān)系，說明所有體系都具有良好的重復(fù)性。且擴增效率可以滿足qPCR反應(yīng)的要求，根據(jù)建立的標準曲線，可對單一或混合樣品中目標鱈魚的含量進行推算。

2.5 市售鱈魚及鱈魚深加工制品的檢測

從當?shù)厥袌鲑彽?3種鱈魚產(chǎn)品(含6種深加工制品)，采用本研究建立的qPCR體系進行物種檢測，并采用常規(guī)PCR方法進行平行檢測。由表3可知，13個檢測樣品中有8個在16S rDNA體系中顯示陽性，表明其確實屬于鱈科(與產(chǎn)品標簽一致)，其中挪威北極鱈(9號和10號樣品)是大西洋鱈魚中的一種，是挪威海產(chǎn)局為了強調(diào)產(chǎn)地和物種另起的商品名稱。13個所測鱈魚產(chǎn)品中未檢出黑線鱈，可能是由于黑線鱈主要銷售于英國市場，在國內(nèi)市場比較少見。深加工樣品(2號和6號)中出現(xiàn)大西洋鱈魚和太平洋鱈魚同時檢出的現(xiàn)象，由于國內(nèi)市場太平洋鱈魚價格低于大西洋鱈魚，因此在加工制品中存在以次充好的現(xiàn)象，但13個檢測樣品中未出現(xiàn)使用異鱗蛇鯖假冒鱈魚的情況。此外，1、4、7、8、12號樣品產(chǎn)品名稱分別為鱈魚腸、鱈魚餅、鱈魚切片、無頭鱈魚和黑鱈魚，但檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不屬于常見的大西洋鱈魚、太平洋鱈魚和黑線鱈，也不屬于鱈科魚類，該結(jié)果與常規(guī)PCR檢測結(jié)果一致(圖3)，表明市場上可能存在標簽造假的現(xiàn)象，但也有可能是鱈形目種類繁多，而本研究中設(shè)計的鑒定鱈科的qPCR引物不能全面覆蓋。

3 討論

當前，我國對鱈魚產(chǎn)品的需求量越來越大，各種鱈魚產(chǎn)品的摻假問題引起了媒體和消費者的廣泛關(guān)注。雖然本研究中并未發(fā)現(xiàn)異鱗蛇鯖假冒鱈魚的情況，但利用異鱗蛇鯖等魚類對鱈魚進行摻偽的行為在世界各國均有報道[21-23]。除鮮銷外，鱈魚也被加工制成烤鱈魚片、鱈魚腸等制品。這對鱈魚種類鑒定方法的有效性和準確性提出了更高的要求[24-27]。本試驗在準確鑒定鱈魚種類的基礎(chǔ)上，建立了檢測3種單一鱈魚樣品(大西洋鱈魚、太平洋鱈魚及黑線鱈)和混合魚肉樣品中鱈科鱈魚成分含量的標準曲線，可用于定量分析。

目前qPCR法在肉類物種鑒定中已廣泛使用[28-29]，主要包括 SYBR Green Ⅰ、Taq Man和Molecular Beacon 3種方法。其中SYBR Green Ⅰ法最為簡便，適用性廣，適用于目的基因定量分析、基因表達量的研究及物種鑒別，但熒光染料是與體系中的所有雙鏈DNA非特異性結(jié)合，結(jié)果可能受引物非特異性擴增或二聚體的影響[30]。因此該方法對引物的設(shè)計要求比較高。

本研究使用DNAStar軟件的MegAlign工具分析比較了不同鱈魚之間線粒體DNA序列的差異，發(fā)現(xiàn)Cytb基因表現(xiàn)出的種內(nèi)和種間差異高于16S rDNA、12S rDNA及COI基因，而差異最小的為16S rDNA基因。因此，選擇16S rDNA基因設(shè)計區(qū)分鱈科與非鱈科的引物，選擇Cytb基因設(shè)計鱈魚種類特異性引物。但本試驗所研究的3種鱈魚的遺傳關(guān)系較近，Cytb基因差距較小，對引物設(shè)計時的高特異性要求有一定的影響。因此，在3種鱈魚的特異性擴增體系中，當Ct值達到33之后出現(xiàn)了非特異性擴增，于是將反應(yīng)的截止點設(shè)定為33循環(huán)，即反應(yīng)的Ct值大于33時出現(xiàn)的擴增判定為陰性(未檢出)。此外，在設(shè)計反應(yīng)體系時，退火溫度極為重要，最佳退火溫度一般取決于體系中引物的熔解溫度(Tm值)[9,31]。本研究采用三步法進行試驗，為確保體系的高擴增效率和高特異性，每種引物需要不斷調(diào)試退火溫度。最終確定大西洋鱈魚和太平洋鱈魚特異性體系反應(yīng)的退火溫度為61℃；南極犬牙魚特異性體系反應(yīng)的退火溫度為55℃；黑線鱈，異鱗蛇鯖特異性反應(yīng)體系及16S rDNA體系反應(yīng)的退火溫度為58℃。

表3 市售鱈魚產(chǎn)品的qPCR檢測Table 3 Detection of commercial cod products by quantitative real-time PCR assays

注：M：100 bp DNA marker；1～2：鱈魚腸；3：鱈魚棒；4：鱈魚餅；5：烤魚片；6：鮮烤魚片；7：鱈魚切片；8：無頭鱈魚；9：挪威北極鱈魚；10：挪威北極鱈魚排；11：鮮活鱈魚；12：野生黑鱈魚；13： 狹鱈魚片。Note: M: 100 bp DNA marker. 1-2: Cod sausage. 3: Cod stick. 4: Cod cake. 5: Roast fish fillets. 6: Fresh roast fish fillets. 7: Cod fillet. 8: Headless cod. 9: Norwegian Arctic cod. 10: Norwegian Arctic cod steak. 11: Fresh cod. 12: Black cod. 13: Pollock fillt.圖3 市售鱈魚產(chǎn)品的常規(guī)PCR檢測Fig.3 Detection of commercial cod products by conventional PCR assays

本研究在市售樣品檢測中發(fā)現(xiàn)，有5種樣品不屬于鱈科。其中，12號樣品野生黑鱈魚學(xué)名裸蓋魚，為鲉形目黑鲉科魚類，其外形與鱈魚相似，因此也被稱為黑鱈魚。但本研究并未針對裸蓋魚設(shè)計品種鑒定引物，因此無法對其是否與標簽一致做出判斷，只驗證了屬于鱈科的物種。事實上，“鱈魚”并不代表任何特定的物種，需要添加“大西洋”或“太平洋”等限定詞來確定物種[21]。這些結(jié)果表明市場上對海鮮產(chǎn)品缺乏系統(tǒng)的命名，而從為商業(yè)欺詐創(chuàng)造了條件。此外，當鱈魚被制成深加工制品時，會有不良商家以次充好，摻雜價格較低的鱈魚或者其他肉類，如雞肉等。在加工過程中，DNA的降解以及反應(yīng)抑制劑的存在會影響擴增時的Ct值，對正確的物種鑒定造成障礙[32]。而本研究建立的16S rDNA體系能夠順利檢測出樣品是否含有鱈魚DNA，利用種類特異性體系能夠分區(qū)出常見的3種鱈魚，結(jié)合標準曲線，根據(jù)Ct值對其中的鱈魚含量進行定量分析。本研究建立的16S rDNA體系及3種鱈魚特異性體系在模擬混合樣品的相對靈敏度均可達0.01%，通過對13種市售樣品的檢測，可檢測出未加工及深加工產(chǎn)品中的鱈魚成分，且整個過程能在半個工作日內(nèi)完成。

4 結(jié)論

本研究選擇16S rDNA基于設(shè)計了針對鱈科魚類的特異性引物，選擇線粒體Cytb基因設(shè)計區(qū)分常見的3種鱈魚(大西洋鱈、太平洋鱈和黑線鱈)，首次建立了針對黑線鱈的qPCR體系。16S rDNA體系和3種物種特異性體系都具有較強的特異性。在此基礎(chǔ)上建立了兩套標準曲線，能對單一或混合樣品中的目標鱈魚進行定量檢測。通過13種鱈魚類產(chǎn)品檢測表明本研究建立的qPCR體系具有較強的實用性，能滿足日常檢測的要求。