譚延肖 鄭現(xiàn)和 石 瑩 趙文超 馬鋒旺 劉長海，*

(1 德州市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 德州 253015；2 西北農(nóng)林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100)

半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)是生物體內(nèi)特異性與半胱氨酸蛋白酶結(jié)合，并抑制其活性的一類蛋白[1]。它們通?？梢耘c木瓜蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶的活性中心結(jié)合，抑制其催化活性，或者與酶的變構(gòu)部位結(jié)合成緊密的復合物，阻止酶原轉(zhuǎn)化成有活性的酶，從而抑制相關蛋白質(zhì)的降解[2-3]。Cystatin在生物體內(nèi)廣泛存在，在哺乳動物、昆蟲和植物中均有報道[4]。Abe 等[5]在1987年首次從水稻種子中克隆到cystatin基因的植物同源物，隨后在小麥、馬鈴薯等80多個物種中成功克隆和鑒定到cystatin基因[6]。

在植物中，cystatin參與調(diào)控植株發(fā)育、種子萌發(fā)、葉片衰老及細胞程序性死亡等生物學過程[7-9]。此外，cystatin也參與植物對干旱、高鹽、極端溫度等環(huán)境脅迫的響應[10-13]。近年來，一些研究也發(fā)現(xiàn)，cystatin在植物應對害蟲和某些病原菌引起的生物脅迫過程中也發(fā)揮了非常重要的作用[14]。Haq 等[15]將原核表達的cystatin蛋白通過體外飼喂有害昆蟲，發(fā)現(xiàn)其體重明顯下降，生長明顯受到抑制。同時，通過轉(zhuǎn)基因手段將水稻等的cystatin基因?qū)敫收嶂参矬w內(nèi)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物對線蟲、豆象等有害昆蟲的侵襲有顯著抗性[16-17]。Roby等[18]觀察到西瓜感染菜豆炭疽菌(Colletotrichumlagenarium)后，葉片內(nèi)的tin蛋白含量會上升。將植物cystatin體外純化蛋白添加到培養(yǎng)植物病原真菌的培養(yǎng)基中，病原真菌的孢子萌發(fā)及菌絲體生長均受到明顯抑制[19-22]。

蘋果(Malusdomestica)是世界上栽植面積最大的果樹之一。我國蘋果栽植面積和產(chǎn)量均居世界首位，但其往往受到干旱、高鹽、極端溫度及病蟲害等不良外界環(huán)境的制約[23-24]。本研究前期在蘋果屬楸子(M.prunifolia)葉片中克隆到一個cystatin基因MpCYS4(GenBank登錄號：KF477275)[25]，利用農(nóng)桿菌介導法將其在蘋果矮化砧木M26中進行過量表達后可以提高植株對干旱脅迫的抗性[26]。本研究以MpCYS4過表達株系為試驗材料，探索MpCYS4基因在蘋果響應褐斑病病原菌侵染過程中的功能，鑒定過表達株系材料的抗病性，同時，對MpCYS4融合蛋白進行體外誘導純化和抑菌活性分析，以期為進一步揭示蘋果MpCYS4基因的生物學功能奠定基礎，為蘋果抗逆育種提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以蘋果矮化砧木M26野生型(WT)和MpCYS4過表達株系#1、#3、#4為試驗材料[26]，栽植于陜西省楊凌區(qū)西北農(nóng)林科技大學園藝場溫室內(nèi)(34°20′N，108°24′E)。

供試菌株：子囊菌門蘋果盤二孢DiplocarponmaliY. Harada & Sawamura。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘋果褐斑病病菌(Diplocarponmali)分離與接種 蘋果褐斑病病菌分離純化：參考殷麗華[27]的方法，在田間收集有單一典型癥狀且?guī)в蟹稚咦颖P的蘋果褐斑病病葉，將其置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃黑暗保濕培養(yǎng)2～3 d，待產(chǎn)生白色分生孢子時，于顯微鏡下根據(jù)孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒定病原菌[28]，接種針挑取，用無菌水配制1×106個·mL-1孢子懸浮液。用接種環(huán)接種少量孢子懸浮液于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar medium，PDA)，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。待病原菌生長為直徑約1 cm的菌落后，鏡檢，并挑取邊緣少量菌絲于新的PDA培養(yǎng)基上，進行二次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。如此經(jīng)過3～4 次轉(zhuǎn)接后，可使菌種得到純化。每次轉(zhuǎn)接前，需對菌落形態(tài)和顏色進行觀察，同時鏡檢，確認為蘋果褐斑病菌。

病原菌回接鑒定：在抗性鑒定之前，為確保分離得到的是蘋果褐斑病病原菌，采用噴霧法將分離純化的孢子懸浮液接種于田間采集的蘋果健康葉片，10片為一組，重復3次。置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃保濕培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

蘋果褐斑病抗性鑒定：田間采集從底部數(shù)第9～第12葉位完全展開、生長健康的M26野生型和轉(zhuǎn)基因株系葉片，無菌水沖洗葉表面。將葉柄在無菌水中剪去末端，脫脂棉包裹，葉片晾干后，接種20 μL分生孢子懸浮液，置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃黑暗保濕培養(yǎng)，10 d后調(diào)查發(fā)病情況并統(tǒng)計病情指數(shù)。根據(jù)發(fā)病程度制定5級分級標準[27]：0 級：無病害癥狀；1 級：病斑面積≤10%；2 級：10%<病斑面積≤30%；3 級：30%<病斑面積≤50%；4 級：50%<病斑面積≤75%；5 級：病斑面積>75%。

發(fā)病率=發(fā)病葉片數(shù)/調(diào)查總?cè)~片數(shù)×100%

(1)

病情指數(shù)(disease index，DI)=Σ(病級葉片數(shù)×該級代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高發(fā)病級代表值)×100%

(2)。

1.2.2MpCYS4基因表達分析 蘋果M26野生型葉片在接種病原菌后0、2、4、6、8 d分別取樣，于-80℃保存，用于RNA提取，以非接種病毒菌葉片為對照。MpCYS4基因表達水平通過實時熒光定量PCR進行檢測[26]。以MpActin為內(nèi)參基因，每5個處理葉片混合為一個RNA樣本，進行3次生物學重復。

1.2.3 MpCYS4融合蛋白純化及活力測定 MpCYS4融合蛋白誘導及純化參考Tan等[26]的方法。將構(gòu)建的pET-32a-MpCYS4表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，挑取單菌落接種于含100 mg·L-1氨芐青霉素(Amp)的Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜，然后以1∶100重新接種，培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)至終濃度為0.1 mmol· L-1，16℃下誘導表達12 h。誘導結(jié)束后收集菌體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察融合蛋白的表達情況。經(jīng)Ni-NTA親和層析法進行蛋白純化,純化后蛋白濃度測定使用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(美國sigma公司)進行。

將200 μL 1 mg·mL-1木瓜蛋白酶溶液、l mL 0.5 mol· L-1磷酸二氫鈉溶液加入離心管中，37℃條件下靜置3 min；試驗組加入1 mL含有0、5、10、20、30 μg·mL-1的MpCYS4重組蛋白溶液，對照組加入相應濃度pET-32a空載體蛋白，37℃下靜置4 min，然后分別加入500 μL 1 mg·mL-1苯甲?；?L-精氨酸-對硝基苯胺(benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide)作為底物，37℃條件下反應20 min，用20%乙酸終止反應。用UV-2550分光光度計(日本SHIMHDZU公司)分別測定405 nm處的吸光值，確定半胱氨酸蛋白酶的相對活性[29]。

1.2.4 MpCYS4蛋白體外抑菌活性分析 將蘋果褐斑病病菌在PDA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)[30]，在無菌水中分離純化孢子，并將其濃度調(diào)整為1×106個·mL-1。 將50 μL孢子懸浮液加入10 mL PCDA液體培養(yǎng)基中，分別加入0、10、20、30、40、50 μg·mL-1體外純化的MpCYS4融合蛋白，25℃振蕩培養(yǎng)24 h，以50 μg·mL-1PET-32a空載體蛋白為對照。在492 nm波長處測定吸光度值，分析蘋果褐斑病病菌的生長差異[31]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各試驗處理均重復3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計進行3次生物學重復。采用Microsoft Office Excel 2010和SPSS 11.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，使用Sigma Plot軟件作圖，并應用獨立樣本的t檢驗對變量進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MpCYS4基因?qū)μO果褐斑病病原菌侵染誘導的響應

在不同時間點對接種褐斑病病原菌的M26葉片進行取樣，提取總RNA，采用實時熒光定量PCR檢測MpCYS4的表達水平。由圖1可知，接種病原菌2 d后，MpCYS4基因表達水平迅速上升到最高值，4～8 d后其表達水平持續(xù)下降。以噴布無菌蒸餾水為對照，在檢測過程中MpCYS4基因表達水平無明顯變化，表明MpCYS4的表達明顯受到蘋果褐斑病病原菌的誘導。

注：**、***分別表示在0.01、0.001水平上差異顯著。下同。Note：** indicates significant difference at 0.01 level, *** indicates significant difference at 0.001 level. The same as following.圖1 蘋果MpCYS4對蘋果褐斑病的響應Fig.1 The response of apple MpCYS4 to Diplocarpon mali infection

2.2 蘋果MpCYS4基因過表達株系葉片抗性鑒定

在抗性鑒定前，將分離純化得到的病原菌，對田間蘋果健康葉片進行了回接鑒定。接種7 d后接種點出現(xiàn)病斑，與田間自然發(fā)病的癥狀相似。通過對接種葉片的再分離、培養(yǎng)形狀和病原形態(tài)學觀察，接種病原菌的發(fā)病葉片均再次分離得到與接種菌一致的菌，證明回接菌株是蘋果褐斑病病原菌。

隨后，對野生型和轉(zhuǎn)基因M26蘋果葉片進行了抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)病菌接種10 d后，野生型葉片褐色病斑多且連接成片，而轉(zhuǎn)基因株系葉片病斑數(shù)量明顯較少、發(fā)病情況明顯較輕(圖2)。發(fā)病情況統(tǒng)計顯示，接種10 d后，野生型葉片接種點的發(fā)病率達到90%，轉(zhuǎn)基因葉片僅為60%～70%。此外，轉(zhuǎn)基因接種葉片的病情指數(shù)也顯著低于野生型植株(圖3)。綜上說明，MpCYS4過量表達顯著提高了蘋果葉片對褐斑病的抗性。

圖2 褐斑病接種10 d后野生型和MpCYS4轉(zhuǎn)基因株系(#1、#3、#4)葉片發(fā)病情況Fig.2 Phenotypes of apple leaves (wild-type and transgenic line #1，#3，and #4) after inoculation with Diplocarpon mali for 10 days

2.3 MpCYS4融合蛋白誘導及活力分析

為確定MpCYS4融合蛋白的活性，以木瓜蛋白酶為底物進行體外試驗。由圖4-A、 B可知，純化得到的MpCYS4目的蛋白純度較好，對木瓜蛋白酶的活力具有明顯的抑制效果，且這種抑制效應隨著反應體系中MpCYS4蛋白含量的增加而增強。

2.4 MpCYS4融合蛋白抑菌活性分析

由圖5-A、B可知，加入空載體pET-32a的蛋白粗提液與不加任何蛋白的褐斑病病菌生長結(jié)果相似，OD492基本相等；加入MpCYS4融合蛋白的褐斑病培養(yǎng)液OD492明顯小于對照。且隨著MpCYS4蛋白濃度增加，OD492減小，抑菌活性增強。上述結(jié)果初步顯示，MpCYS4融合蛋白對蘋果褐斑病具有一定的生長抑制作用。

圖3 褐斑病接種10 d后野生型和MpCYS4轉(zhuǎn)基因株系(#1，#3，#4)葉片發(fā)病率及病情指數(shù)Fig.3 Incidence and disease index of apple leaves (wild-type and transgenic line #1，#3，and #4) after inoculation with Diplocarpon mali for 10 days

注：1：純化的MpCYS4-His融合蛋白；2：經(jīng)IPTG誘導12 h的總可溶性蛋白；3：未經(jīng)IPTG誘導的總可溶性蛋白。Note: 1: Purified recombinant MpCYS-His fusion protein. 2: Total soluble protein fraction after 12 h of IPTG induction. 3: Total soluble protein fraction without IPTG induction.圖4 MpCYS4融合蛋白對半胱氨酸蛋白酶活性的抑制效應Fig.4 Inhibition of MpCYS4 fusion protein on cysteine proteinase activity

圖5 MpCYS4融合蛋白對蘋果褐斑病菌的抑制活性Fig.5 Antifungal activity of MpCYS4 recombinant protein to Diplocarpon mali

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在植物對害蟲和某些病原菌的侵染防御響應中cystatin發(fā)揮著重要的作用，它們通過調(diào)節(jié)蛋白酶活性和蛋白質(zhì)代謝，保護細胞、組織及器官中的蛋白質(zhì)免受來自病原微生物和昆蟲等外源蛋白水解酶的水解，參與一系列生理病理反應過程，形成生物體免疫系統(tǒng)的重要組分[32]。有報道稱cystatin可抑制鱗翅目、鞘翅目等有害昆蟲消化道內(nèi)半胱氨酸蛋白酶的活性，擾亂其體內(nèi)的正常代謝，最終導致發(fā)育不正常而死亡[33]。植物cystatin抗蟲作用機制的研究報道較多，但對其抗病功能機制的研究還很缺乏[21, 32]。

本研究結(jié)果表明，褐斑病病原菌侵染可誘導MpCYS4基因的表達顯著上調(diào)。在M26中過量表達，離體葉片接種褐斑病病菌后，轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比發(fā)病情況明顯減輕。將MpCYS4體外純化蛋白添加在培養(yǎng)褐斑病病原真菌的培養(yǎng)基中，病原真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長受到明顯抑制，這與前人報道的一致[19-22]。表明蘋果MpCYS4基因參與其對褐斑病病菌的防御反應，且具有抑制蘋果褐斑病病菌生長的作用，但相關的作用機理仍有待深入研究。

有研究者認為，病原微生物需要依賴胞外蛋白酶降解寄主組織，以獲得其生長和增殖所需的氨基酸，實現(xiàn)其侵染與擴展。而植物則可能通過分泌蛋白酶抑制劑阻止病原菌蛋白酶對寄主組織的降解，導致其營養(yǎng)不足，生長和增殖受限，達到抗病的目的[34]。也有報道表明，cystatin對病原真菌生長的抑制作用與病原菌體內(nèi)半胱氨酸蛋白酶的活性并無直接關系，可能通過影響真菌細胞壁的形成或者改變細胞膜的通透性，影響病原真菌的生長[35]。因此，cystatin在植物抗病反應中的相關作用機理仍有待進一步探究。

4 結(jié)論

本研究表明，蘋果MpCYS4基因的表達受褐斑病病原菌侵染的誘導，在蘋果矮化砧木M26中過量表達MpCYS4明顯提高了葉片對褐斑病的抗性。將MpCYS4體外純化蛋白添加在培養(yǎng)褐斑病病原菌的培養(yǎng)基中，病原菌孢子的萌發(fā)和菌絲生長均受到明顯抑制。本研究為進一步探究MPCYS4的生物學功能及其抗病作用機制奠定了基礎，也為蘋果抗逆育種提供了新的理論依據(jù)。