趙晉鋒 杜艷偉 余愛麗

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)/山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所/特色雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西 長(zhǎng)治 046011)

蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase，MDH)是光合作用以及生命活動(dòng)中的關(guān)鍵酶，主要功能是催化蘋果酸和草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，是動(dòng)植物生命活動(dòng)中的重要中間產(chǎn)物[1]。MDH廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的生理生化活動(dòng)，如三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)、C4循環(huán)、脂肪酸的氧化、呼吸作用、氮同化等[2]。相關(guān)研究揭示MDH與植物種子萌發(fā)、葉綠體含量及結(jié)構(gòu)、花粉發(fā)育、淀粉合成、糖積累、果實(shí)發(fā)育和成熟、果實(shí)酸度以及抗逆等生理過程密切相關(guān)[3-6]。

研究表明，MDH在植物細(xì)胞中以多種形式的亞型存在，不同亞型的MDH具有其特定的輔酶NAD(NADP)。不同亞型MDH通常存在于不同的細(xì)胞器中，根據(jù)其輔酶及亞細(xì)胞位置的不同，MDH分為線粒體NAD-MDH、微體NAD-MDH、葉綠體NAD-MDH、葉綠體NADP-MDH及細(xì)胞質(zhì)NAD-MDH[7]。Eubel等[8]報(bào)道擬南芥中存在多種NAD-MDH亞型，不同亞型NAD-MDH所在細(xì)胞器以及參與代謝途徑不同，具有不同的生理生化功能。目前國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)從多種植物中克隆得到了MDH基因并開展了廣泛研究，主要包括水稻、玉米、大豆、蘋果、棉花、甘蔗、綠豆、番茄、香蕉、木薯、苜蓿等[9-10]。目前，MDH與抗逆相關(guān)性方面研究較少。張覓等[11]從香橙根中克隆了MDH基因，發(fā)現(xiàn)在煙草中超量表達(dá)MDH可以提高植株對(duì)鋁毒的耐受能力。MDH基因在苜蓿中超量表達(dá)后，可以顯著增強(qiáng)苜蓿對(duì)酸性土壤的適應(yīng)力并提高鋁毒耐受性[12]。張建斌等[13]從香蕉果實(shí)中克隆得到MDH基因，發(fā)現(xiàn)在乙烯利處理下香蕉苗中MDH基因上調(diào)表達(dá)，在鋁離子鹽脅迫及香蕉枯萎病菌侵染幼苗時(shí)MDH表達(dá)呈先上升后下降趨勢(shì)，在冷害脅迫下呈先下降后上升趨勢(shì)，推測(cè)香蕉MDH基因可能在抵抗衰老、重金屬鋁、低溫脅迫及枯萎病菌侵染等逆境中發(fā)揮重要作用。水稻OsMDH1在葉片、葉鞘、圓錐花序等不同組織中均有表達(dá)；鹽脅迫下，在穎片、芽、根和莖等組織中OsMDH1均被誘導(dǎo)表達(dá)；進(jìn)一步研究表明OsMDH1通過影響水稻組織維生素B6含量來負(fù)調(diào)控鹽脅迫應(yīng)答[14]。

谷子(Setariaitalica)是起源于我國(guó)的C4禾本科重要糧食作物和飼草作物，具有抗旱、耐瘠、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)[15-17]。在生長(zhǎng)發(fā)育過程中谷子經(jīng)常遭遇干旱、鹽漬、低溫、高溫、洪澇以及病蟲害侵染，嚴(yán)重影響了谷子的生長(zhǎng)發(fā)育[18]。谷子基因組測(cè)序工作在2012年完成并公布，這為開展谷子抗逆分子生物學(xué)研究提供了極為便利的條件[19-20]。目前，有關(guān)MDH研究主要聚集在細(xì)胞的多種生理活動(dòng)以及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，在植物上主要涉及番茄、大豆、苜蓿、香蕉等作物，但MDH基因在抗逆方面的表達(dá)調(diào)控研究鮮有報(bào)道，且MDH與逆境關(guān)系還缺乏系統(tǒng)深入的研究，尤其是在典型C4抗逆作物谷子中MDH的表達(dá)及功能還有待研究。因此，本研究通過序列比對(duì)得到2個(gè)谷子MDH基因(SiMDH1和SiMDH2)，通過網(wǎng)站在線工具和軟件對(duì)其氨基酸序列、蛋白特征、功能、信號(hào)途徑、順勢(shì)應(yīng)答元件等參數(shù)特征進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，隨后分析了它們?cè)谟酌缙谀婢趁{迫下的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式，以及在拔節(jié)、抽穗、灌漿3個(gè)主要生育時(shí)期干旱脅迫和不同光照處理下的表達(dá)情況，旨在進(jìn)一步分析MDH基因在谷子逆境應(yīng)答信號(hào)途徑中的功能和機(jī)制，為利用基因工程方法改善作物光合速率和提高產(chǎn)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為谷子品種豫谷1號(hào)，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所生物技術(shù)課題提供。

TRIzol試劑，購自生工生物工程(上海)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、LATaqDNA 聚合酶和RNA 酶抑制劑，購自寶生物工程有限公司；其他試劑均購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 脅迫處理試驗(yàn)

在組培室中培養(yǎng)谷子幼苗，溫度為42～24℃，相對(duì)濕度為60%, 光照周期為16 h光照/8 h黑暗。待組培室幼苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)分別對(duì)其進(jìn)行20% 模擬干旱[20%聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)6000]、鹽 (250 mmol·L-1NaCl)、脫落酸(abscisic acid，ABA)(100 μmol·L-1) 和低溫(cold)(4℃) 脅迫處理，逆境表達(dá)譜分析取樣時(shí)間點(diǎn)為處理后0、1、3、6、12、24 h，整株取樣[21]。對(duì)照(CK)生育期內(nèi)正常澆水；干旱處理只澆3次關(guān)鍵水。光照處理為當(dāng)植株出苗后用黑色遮陽網(wǎng)分別遮擋一層(光照Ⅰ中等光照，拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期測(cè)量光照強(qiáng)度分別為1.32×104、2.45×104、0.98×104lx)，兩層(光照Ⅱ弱光照，拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期測(cè)量光照強(qiáng)度分別為0.31×104、0.57×104、0.35×104lx) 至成熟收獲。使用GM1040標(biāo)智光強(qiáng)測(cè)定儀(上海雙旭電子有限公司)于晴天上午9:00-10:00測(cè)量光照強(qiáng)度，測(cè)量10次，取平均值。其他農(nóng)田管理措施相同。旱棚材料分別在拔節(jié)、抽穗、灌漿期時(shí)取對(duì)照和處理旗葉葉片，所有樣品葉片取樣后立即在-80℃冰箱中速凍備用。試驗(yàn)均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 谷子MDH基因的鑒定及基因結(jié)構(gòu)、蛋白序列分析

在Phytozome數(shù)據(jù)庫中以擬南芥MDH為遞交序列, 進(jìn)行BLASTP比對(duì)，搜索具有完整閱讀框的谷子同源序列，獲得谷子候選MDH基因。蛋白分子量和等電點(diǎn)利用ExPASy網(wǎng)站在線工具預(yù)測(cè)?；騿?dòng)子區(qū)域順式元件利用PLACE在線軟件分析，基因結(jié)構(gòu)圖采用GSDS軟件繪制，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)使用Psort在線工具，使用BLAST工具在NCBI上查找不同物種氨基酸同源性序列，采用ClustalX1.83軟件[22]分析基因序列；利用Mega6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建不同物種系統(tǒng)進(jìn)化樹[23]。

1.4 植物總RNA提取、cDNA 合成及引物設(shè)計(jì)

植物總RNA提取使用TRIzol試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；cDNA合成使用生工第一鏈cDNA合成試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]，上述試驗(yàn)均按照試劑盒說明書進(jìn)行。所用引物均采用Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。試驗(yàn)所需其他試劑參照《分子克隆》[24]配制。

1.5 qPCR分析

樣品cDNA均一化后作為實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative PCR, qPCR)模板，以谷子SiGAPB基因作為內(nèi)參基因。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×熒光染料混合液、0.4 μL正向引物(10 μmol·L-1)、0.4 μL反向引物(10 μmol·L-1)、2 μL cDNA模板，7.2 μL無菌水。qPCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性7 s，57℃退火10 s，72℃延伸15 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理3次重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因在逆境處理下各時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于CK的轉(zhuǎn)錄水平變化[25]。采用SPSS 19.0軟件對(duì)qPCR分析結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。苗期不同逆境下表達(dá)分析結(jié)果利用百邁克云平臺(tái)在線工具聚類熱圖繪制(pretty heatmaps)進(jìn)行熱圖繪制，參數(shù)默認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDH基因鑒定與參數(shù)分析

通過序列比對(duì)和分析, 從谷子中得到2個(gè)SiMDH基因，根據(jù)在基因組上相應(yīng)位置分別命名為SiMDH1和SiMDH2。其中SiMDH1位于2號(hào)染色體上15714933～15719067區(qū)間，SiMDH2位于6號(hào)染色體上35757958～35761505區(qū)間(表1)。進(jìn)一步檢索發(fā)現(xiàn)SiMDH1只有1種轉(zhuǎn)錄，編碼452個(gè)氨基酸，而SiMDH2有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本SiMDH2-1和SiMDH2-2，分別編碼438和333個(gè)氨基酸，由于SiMDH2-2 N端少105個(gè)氨基酸，因此其序列較短。后續(xù)表達(dá)分析時(shí)僅將SiMDH2原始轉(zhuǎn)錄變異體SiMDH2-1對(duì)應(yīng)的序列作為該基因的代表。功能域分析發(fā)現(xiàn)，SiMDH1和SiMDH2都含有MDH基因特征功能域Ldh_1_N (蘋果酸酶NAD結(jié)合功能域)和 Ldh_1_C(蘋果酸酶C端功能域)。在相關(guān)網(wǎng)站對(duì)SiMDH蛋白的等電點(diǎn)、分子量、分子式、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)和平均疏水性等進(jìn)行預(yù)測(cè)，詳見表1。GSDS 在線軟件分析基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，SiMDH1和SiMDH2-1均含13個(gè)內(nèi)含子，而SiMDH2-2含11個(gè)內(nèi)含子(圖1)。

表1 預(yù)測(cè)谷子MDH基因參數(shù)Table 1 Parameters of predicted foxtail millet MDH genes

圖1 SiMDH 成員基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of SiMDH genes

2.2 MDH基因氨基酸序列比對(duì)與進(jìn)化分析

ClustalX1.83軟件比對(duì)氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，SiMDH1、SiMDH2-1和SiMDH2-2之間序列比較保守，相似性較高，其序列相似性為72.34%。為進(jìn)一步了解谷子SiMDH進(jìn)化關(guān)系，推測(cè)其生物功能，在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索了不同物種(擬南芥、高粱、水稻、玉米)已知MDH基因，包括擬南芥AtMDH1、AtMDH2，高粱SbMDH1、SbMDH2，水稻OsMDH1、OsMDH12，玉米ZmMDH1、ZmMDH2，對(duì)應(yīng)GeneBank蛋白序列號(hào)分別為AT3G47520.1、AAK00366.1， KXG26853.1、KXG24112.1，BAD09842.1、 BAG97452.1，ACG34976.1、AAB64290.1。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，OsMDH2序列與SiMDH1、SiMDH2-1和SiMDH2-2 同源性較高，序列相似性分別為67.86%、75.42%和65.97%，但所有MDH序列整體相似性較低，僅為41.62%，圖2揭示MDH基因在進(jìn)化過程中序列變化較大，保守性較差。發(fā)育樹中(圖3)所有MDH成員相互嵌合在一起，表明 MDH基因在單、雙子葉植物分化前就已經(jīng)存在。此外，一些同源基因?qū)Φ拇嬖冢鏢iMDH2和OSMDH2、ZmMDH2和SbMDH1、SbMDH2和AtMDH2、ZmMDH1和OsMDH1，揭示它們可能由共同祖先進(jìn)化而來，且在功能上可能具有類似的生物功能。

2.3 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和啟動(dòng)子區(qū)域順式元件分析

采用Psort在線工具對(duì)谷子SiMDH1和SiMDH2的亞細(xì)胞位置進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，SiMDH1和SiMDH2都主要被定位在葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，其中SiMDH1預(yù)測(cè)置信度分別為3.332、0.837和0.321，而SiMDH2預(yù)測(cè)置信度分別為3.382、0.820和0.366。利用PLACE在線軟件對(duì)SiMDH成員啟動(dòng)子順式元件進(jìn)行分析，由表2可知，SiMDH1和SiMDH2成員啟動(dòng)子區(qū)域主要包括大量的光應(yīng)答元件、激素類應(yīng)答元件以及其他生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)順式元件，包括厭氧誘導(dǎo)、分生組織特異性激活、晝夜節(jié)律控制、胚乳表達(dá)、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控、種子特異性調(diào)控、晝夜節(jié)律調(diào)控等元件。SiMDH2不同剪切體啟動(dòng)子區(qū)域存在不同順式元件揭示他們?cè)诠δ苌嫌兴町悺?/p>

注：黑色背景氨基酸表示相同氨基酸殘基，灰色背景氨基酸表示相似氨基酸殘基(≥60% 相似性)；序列中蘋果酸酶特征功能域Ldh_1_N (NAD結(jié)合功能域) 和 Ldh_1_C (C端功能域) 分別用“-”和“·”連字符標(biāo)出。Note：The black background amino acids represent the same amino acid residues, and the gray background amino acids represent similar amino acid residues (≥60% similarity). The Ldh_1_N (NAD-binding) and Ldh_1_C (C-terminal) domains of malate dehydrogenase in the sequence were marked with ‘-’ and ‘·’ hyphens.圖2 SiMDH1和SiMDH2 與其他已知MDH氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Sequences alignment of SiMDH1 and SiMDH2 with other known MDHs

2.4 非生物逆境脅迫下谷子SiMDH基因的表達(dá)分析

由圖4可知，在4種脅迫處理下，谷子幼苗SiMDH1和SiMDH2誘導(dǎo)表達(dá)程度不同，在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平變化趨勢(shì)不完全相同，SiMDH1表達(dá)量上調(diào)趨勢(shì)明顯高于SiMDH2。在ABA-6 h、Cold-24 h、PEG-3 h、NaCl-6 h時(shí)，SiMDH1基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高，分別為各脅迫處理CK的119.16、20.26、30.54和11.64倍；在ABA-6 h、Cold-24 h、PEG-3 h、NaCl-24 h時(shí)，SiMDH2基因相對(duì)表達(dá)量最高，分別為各脅迫處理CK的3.79、3.93、2.92和2.18倍。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，SiMDH1和SiMDH2參與了谷子苗期干旱、鹽、低溫和ABA等逆境脅迫響應(yīng)，尤其是SiMDH1可能在谷子苗期逆境應(yīng)答信號(hào)系統(tǒng)中具有更重要的作用。

表2 啟動(dòng)子區(qū)域順式元件預(yù)測(cè)Table 2 Prediction of cis-elements in promoter region

圖3 MDH氨基酸序列進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of MDH amino acid sequences

2.5 正常生長(zhǎng)、干旱脅迫及不同光照強(qiáng)度下不同生育期谷子SiMDH表達(dá)分析

由圖5可知，在正常生長(zhǎng)條件下，與拔節(jié)期相比，抽穗期、灌漿期的SiMDH1相對(duì)表達(dá)量均有明顯提升，分別為拔節(jié)期的1.73和12.07倍；在干旱脅迫下，與拔節(jié)期相比，抽穗期、灌漿期的SiMDH1相對(duì)表達(dá)量也均有明顯提升，分別為拔節(jié)期的2.02和1.84倍。在正常生長(zhǎng)條件下，與拔節(jié)期相比，抽穗期的SiMDH2相對(duì)表達(dá)量變化不大，而灌漿期SiMDH2表達(dá)量下降；在干旱脅迫下，與拔節(jié)期相比，抽穗期、灌漿期的SiMDH2相對(duì)表達(dá)量均有明顯提升，分別為拔節(jié)期的2.84和1.27倍。

注：淺綠、深綠、黑色、淺紅、深紅代表基因表達(dá)水平，其中綠色表示基因表達(dá)弱，紅色表示基因表達(dá)強(qiáng)。Note：Light green,dark green, black, light red and dark red are used to represent gene expression levels. Green indicates weak gene expression, red indicates strong gene expression.圖4 谷子苗期SiMDH基因在不同脅迫下的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of SiMDH under different stressesing at seedling stage

注：*和**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。下同。Note: * and ** indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively. The same as following.圖5 正常和干旱條件下不同生育期谷子SiMDH1 和SiMDH2 的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of SiMDH1 and SiMDH2 under normal and drought conditions during different growth stages

圖6 光照和干旱條件下谷子SiMDH1和SiMDH2的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of SiMDH1 and SiMDH2 under light and drought conditions

由圖6可知，在干旱條件下，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期SiMDH1相對(duì)表達(dá)量均有上升，分別為相應(yīng)CK(正常生長(zhǎng))的1.43、3.18和1.58倍；在拔節(jié)期中等光照(光照Ⅰ)下SiMDH1相對(duì)表達(dá)量下降，但在弱光(光照Ⅱ)條件下SiMDH1相對(duì)表達(dá)量明顯提高，分別為CK的0.58和1.35倍；在抽穗期和灌漿期的中等和弱光照下SiMDH1相對(duì)表達(dá)量均下降，抽穗期中等和弱光照下SiMDH1相對(duì)表達(dá)量為CK的0.54和0.35倍，灌漿期中等和弱光照下SiMDH1相對(duì)表達(dá)量為CK的0.45和0.61倍。在干旱條件下，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期SiMDH2相對(duì)表達(dá)量均明顯上升，分別為CK的1.46、4.10和3.58倍；在拔節(jié)期中等光照下SiMDH2相對(duì)表達(dá)量下降，而在弱光條件下SiMDH2相對(duì)表達(dá)量明顯提高，分別為CK的0.69和1.32倍；在抽穗期的中等和弱光照下SiMDH2相對(duì)表達(dá)量都下降，分別為CK的0.52和0.57倍，灌漿期中等光照下SiMDH2相對(duì)表達(dá)量略有上升，弱光照下上升明顯，分別為CK的1.03和2.02倍。

不同生育期干旱脅迫表達(dá)譜分析表明，SiMDH1和SiMDH2均參與了谷子拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期的干旱脅迫應(yīng)答。不同光照強(qiáng)度下表達(dá)譜分析結(jié)果表明，2個(gè)MDH基因在不同生育期不同光照強(qiáng)度下表達(dá)水平不同，SiMDH1和SiMDH2在谷子拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期表達(dá)受光照強(qiáng)度影響嚴(yán)重。

3 討論

研究結(jié)果表明，SiMDH1、SiMDH2與其他物種MDH蛋白序列具有較高同源性，它們都含有MDH基因的特征功能域，蘋果酸酶NAD結(jié)合域和蘋果酸酶C端功能域，揭示它們?cè)谶M(jìn)化上比較保守。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，SiMDH1和SiMDH2主要被定位在葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，這些位置都是植物光合作用的關(guān)鍵位置，印證了MDH是光合作用以及生命活動(dòng)中的關(guān)鍵酶，在植物光合作用信號(hào)途徑中起重要作用的觀點(diǎn)。順式元件分析發(fā)現(xiàn)在SiMDH啟動(dòng)子區(qū)域含有大量光應(yīng)答、激素類和其他類應(yīng)答元件。若基因啟動(dòng)子區(qū)域存在某種順式元件則該基因很可能參與相應(yīng)的信號(hào)途徑[26]。研究表明在非生物逆境，如干旱、鹽、低溫、高溫以及傷害等脅迫下會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)的ABA水平升高，眾所周知ABA是在非生物逆境應(yīng)答中起重要作用的激素[27]。因此推測(cè)谷子SiMDH基因很可能參與了植物對(duì)非生物逆境脅迫的響應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)SiMDH1和SiMDH2參與了谷子苗期等逆境脅迫響應(yīng)，尤其是SiMDH1可能在谷子苗期逆境應(yīng)答信號(hào)系統(tǒng)中起更重要的作用。后續(xù)不同生育期干旱脅迫及不同光照強(qiáng)度下表達(dá)譜分析也表明SiMDH1和SiMDH2均參與了拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期的干旱脅迫應(yīng)答。而且不同光照強(qiáng)度會(huì)顯著影響SiMDH1和SiMDH2在不同生育期的表達(dá)情況。研究表明，在光代謝途徑中，NADP-MDH 催化蘋果酸代謝，促進(jìn)草酰乙酸(oxaloacetic acid, OAA)轉(zhuǎn)化為蘋果酸，生成光合作用電子受體 NADP+，參與光合作用。Hebbelmann等[28]對(duì)擬南芥中NADP-MDH進(jìn)行了研究，推測(cè)在高光和低光條件下植物體通過膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸來維持蘋果酸含量的穩(wěn)定，使植物處于氧化還原的平衡狀態(tài)。Heyno等[29]將擬南芥缺失性NADPH-MDH突變體中的過氧化氫酶基因敲除，導(dǎo)致擬南芥H2O2含量增加，突變體相比野生型NADPH含量增加，但生長(zhǎng)無顯著變化，表明MDH在調(diào)控過氧化氫酶活性和清除H2O2起著重要的作用。谷子中的MDH基因是否也在光反應(yīng)中的不同光照強(qiáng)度下參與調(diào)控過氧化氫酶活性和清除H2O2還需進(jìn)一步驗(yàn)證。但本試驗(yàn)結(jié)果表明弱光可誘導(dǎo)拔節(jié)期SiMDH1以及拔節(jié)期和灌漿期SiMDH2基因的表達(dá)，揭示了光照強(qiáng)度會(huì)顯著影響SiMDH1和SiMDH2基因的表達(dá)。順式元件分析還顯示在SiMDH基因啟動(dòng)子區(qū)域存在茉莉酸甲酯、水楊酸、赤霉素等順式原件[30]。研究表明病原體感染通常導(dǎo)致細(xì)胞中茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯等激素水平增加[31]，因此推斷SiMDH基因可能在生物應(yīng)激反應(yīng)中起一定作用。此外，研究表明缺氧特異性誘導(dǎo)(GC-motif)、分生組織表達(dá)(CAT-box)、厭氧誘導(dǎo)必需(ARE)、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控(O2-site)、種子特異性調(diào)控(RY-element)、晝夜節(jié)律(circadian)等核心元件的存在，暗示SiMDH可能參與相應(yīng)的生理生化過程。在啟動(dòng)子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了大量的光應(yīng)答元件，谷子是光溫敏感性作物，而且MDH是光合作用中的關(guān)鍵酶，預(yù)示SiMDH可能參與調(diào)控谷子的光溫應(yīng)答調(diào)控并在其中起重要作用。

4 結(jié)論

本研究從谷子中鑒定出2個(gè)SiMDH基因成員SiMDH1和SiMDH2。序列分析和功能域分析表明它們都含有MDH基因典型特征功能域，與其他物種MDH基因序列具有較高的同源性。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)2個(gè)SiMDH基因被主要定位于細(xì)胞的葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和線粒體，揭示它們是谷子光合作用過程中的重要基因。qPCR逆境表達(dá)分析表明，SiMDH1和SiMDH2廣泛參與了谷子苗期非生物逆境脅迫應(yīng)答。進(jìn)一步分析表明，SiMDH1和SiMDH2成員參與了谷子在拔節(jié)、抽穗、灌漿期的干旱應(yīng)答，而光照強(qiáng)度會(huì)影響SiMDH1和SiMDH2基因在不同生育期的表達(dá)。但是這2個(gè)基因在非生物逆境脅迫下的分子應(yīng)答機(jī)制還需通過轉(zhuǎn)基因的方法進(jìn)一步詳細(xì)驗(yàn)證。本研究為進(jìn)一步揭示MDH基因在谷子非生物逆境應(yīng)答信號(hào)途徑中的機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)。