宮文萍 張 偉 李豪圣 李光蓉 張玉梅 楊足君 劉 成,* 劉建軍,*

(1 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/小麥玉米國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 青島 250208；3 電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610054)

小麥的近緣物種含有小麥育種所需的抗病、抗逆等基因，因此，將其優(yōu)異性狀基因?qū)胄←準(zhǔn)菍?shí)現(xiàn)小麥遺傳改良的重要途徑之一[1]。頂芒山羊草(Aegilopscomosa，又稱(chēng)Triticumcomosum，MM)，作為卵穗山羊草(Ae.geniculata，UUMM)、小亞山羊草(Ae.columnaris，UUMM)、三芒山羊草(Ae.neglecta，UUMM或UUMMNN)、牡山羊草(Ae.juvenalis，DDMMUU)和粗厚山羊草(Ae.crassa，DDMM或DDDDMM)等物種的M染色體組的供體種[2]，具有高抗小麥條銹病[2-3]、葉銹病[4]、稈銹病[2-3,5]、白粉病[6]、禾谷孢囊線(xiàn)蟲(chóng)病[7]、小麥黑森癭蚊病[4]和鹽堿耐受性[8]等優(yōu)異特性，是普通小麥重要的三級(jí)基因源[1]。將小麥三級(jí)基因源與小麥進(jìn)行雜交，通過(guò)胚拯救、染色體加倍或回交等方法，可以獲得相應(yīng)的染色體雙二倍體、附加系或代換系等材料。

小麥-近緣物種雙二倍體、附加系、代換系和易位系等材料是向小麥轉(zhuǎn)移近緣物種優(yōu)異基因的重要橋梁材料[9]，以這些材料為基礎(chǔ)創(chuàng)制的小麥-外源染色體易位系在小麥育種中具有重大的應(yīng)用價(jià)值。例如，育種家們以抗小麥多種病害且豐產(chǎn)性好的小麥-黑麥1RS.1BL易位系及其衍生系為親本，育成了山前麥、高加索、無(wú)芒一號(hào)和洛夫林13等高產(chǎn)抗病小麥，在推動(dòng)小麥品種更新?lián)Q代中發(fā)揮了重要作用[10-12]；以抗條銹病且含普通小麥-長(zhǎng)穗偃麥草易位系的小偃6號(hào)[13]為親本育成了西農(nóng)928、陜優(yōu)225和鄭麥366等50余個(gè)小麥品種；以含抗白粉病基因Pm21的小麥-簇毛麥6VS.6AL易位系為親本，選育出南農(nóng)9918、石麥14、金禾9123和揚(yáng)麥18等20余個(gè)小麥新品種[14-16]；以及輻射處理六倍體小黑麥黑雜266與普通小麥雜交種子選育出含有6BS/6RL易位系的龍輻麥4號(hào)[17]。目前，已有不少小麥-近緣物種染色體易位系被成功創(chuàng)制出來(lái)[18]。然而，僅少數(shù)小麥-近緣物種易位系在小麥生產(chǎn)中得到廣泛利用[10]，原因可能是導(dǎo)入小麥中的近緣物種染色體片段無(wú)法補(bǔ)償被替換染色體片段的某些優(yōu)異性狀，或者是易位系所在小麥背景較差不適宜直接應(yīng)用等[19-20]。但小麥-近緣物種染色體易位系作為定位小麥近緣物種優(yōu)異基因的有效工具，是向小麥轉(zhuǎn)育優(yōu)異基因的重要載體，有必要?jiǎng)?chuàng)制更多的小麥-近緣物種染色體易位系。

對(duì)小麥-近緣物種染色體雙二倍體、附加系、代換系等材料的抗病性和農(nóng)藝性狀進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，是創(chuàng)制小麥-近緣物種染色體易位系的重要前提[21]。本研究利用頂芒山羊草2M染色體特異分子標(biāo)記結(jié)合多聚核苷酸熒光原位雜交對(duì)小麥-頂芒山羊草雜交育成的新種質(zhì)進(jìn)行鑒定，并對(duì)其三銹病和白粉病抗病性進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)一年四點(diǎn)對(duì)小麥-頂芒山羊草新種質(zhì)的株高、旗葉長(zhǎng)和旗葉寬等8個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查研究，綜合評(píng)價(jià)所獲得的小麥-頂芒山羊草染色體系的育種應(yīng)用潛力，以期為后續(xù)開(kāi)發(fā)利用這批種質(zhì)資源提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小麥品種濟(jì)麥22(Jimai22)、濟(jì)麥23(Jimai23)、濟(jì)麥229(Jimai229)和濟(jì)麥262(Jimai262)由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥遺傳育種團(tuán)隊(duì)育成。小麥中國(guó)春(Chinese Spring，CS)由電子科技大學(xué)楊足君教授提供。中國(guó)春-頂芒山羊草雙二倍體(XX019)，中國(guó)春-頂芒山羊草2M～7M附加系(JIC-3～JIC-8)，普通小麥品種Hobbit ‘sib’(JIC-46)，以及Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草異染色體系JIC-10、JIC-11、JIC-12、JIC-17，均由英國(guó)約翰英納斯中心(John Innes Centre)的Reader SM教授提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增 供試材料基因組總DNA提取方法參考文獻(xiàn)[20]。PCR所用IT(intron target)引物根據(jù)簇毛麥基因內(nèi)含子區(qū)多態(tài)性設(shè)計(jì)[22]，合成的染色體第一至第七同源群引物分別為135、175、120、89、140、71、111對(duì)。引物由青島擎科天成生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[22]，PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，然后于GDS-Gel Dol 2000紫外凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)下掃描照相。

頂芒山羊草2M染色體特異基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獨(dú)特基因標(biāo)記(PCR-based landmark unique gene, PLUG)TNAC1138、TNAC1204、TNAC1137、TNAC1239、TNAC1206和TNAC1102對(duì)應(yīng)引物[23]由成都瑞信生物公司合成， PCR擴(kuò)增程序參考Ishikawa等[24]的方法?；贑S reference V1.0的BLASTN，將PLUG序列定位在小麥染色體(區(qū)段)上，所用網(wǎng)頁(yè)(http://mcgb.uestc.edu.cn/tnac)由電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院楊足君教授課題組創(chuàng)建。

1.2.2 根尖處理與原位雜交 將種子置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，于22℃恒溫光照培養(yǎng)箱萌發(fā)。待種子萌動(dòng)露白后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)到4℃冰箱中低溫處理24 h， 再放入22℃光照培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，待根尖長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，剪下根尖，用冰水處理 24 h。之后用卡諾氏固定液Ⅰ(無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3∶1，v/v)固定根尖7 d以上，壓片備用。

染色體壓片參照文獻(xiàn)[25]。以多聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1對(duì)供試材料染色體制片進(jìn)行雙色熒光原位雜交，熒光原位雜交和染色體制片的洗脫方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[26]。雜交探針由成都瑞信生物公司合成。用BX53熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)進(jìn)行鏡檢，DP70CCD拍照。

1.2.3 抗病性鑒定 供試材料抗條銹病鑒定在電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院完成，所用菌種為CYR32、CYR33和Su-4混合生理小種；抗葉銹病鑒定在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院完成，所用菌種為09-9-1441-1、09-9-1426-1、09-7-922-1、09-7-949-1和09-9-1505-1混合生理小種；抗稈銹菌病鑒定在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院完成，所用菌種為34MKGQM和21C3CTHSM混合生理小種；抗白粉病鑒定在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所完成，所用白粉菌混合菌株采集于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所濟(jì)南試驗(yàn)基地(未鑒定具體小種)。4種病害接種方式、發(fā)病條件及發(fā)病等級(jí)統(tǒng)計(jì)方法分別參照文獻(xiàn)[20, 27-29]。

1.2.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查 供試材料分別種植于山東省濟(jì)南市(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所試驗(yàn)基地)、德州市(德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)基地)、菏澤市(菏澤市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地)和臨沂市(臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地)，澆水、施肥、鋤草和病蟲(chóng)害處理等管理?xiàng)l件一致。各供試材料隨機(jī)播種3行(行長(zhǎng)4 m)，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，嚴(yán)格按行距33 cm，株距20 cm進(jìn)行播種，四周種植濟(jì)麥22避免邊行效應(yīng)影響。每個(gè)供試材料隨機(jī)取10株，于成熟期旗葉變干卷曲前，分別調(diào)查其株高、穗長(zhǎng)、旗葉長(zhǎng)、旗葉寬、分蘗數(shù)和主莖小穗數(shù)。每個(gè)供試材料隨機(jī)取30穗，完全干燥后人工脫粒，分別調(diào)查其30穗穗粒數(shù)和30穗穗粒重。種植于濟(jì)南的供試材料未獲得分蘗數(shù)結(jié)果。

調(diào)查結(jié)果采用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行方差分析。4個(gè)種植地調(diào)查結(jié)果完全一致的(如與對(duì)照相比，四地籽粒數(shù)均顯著減少)，則認(rèn)為是外源染色體導(dǎo)入所致，否則認(rèn)為是外源染色質(zhì)導(dǎo)入和環(huán)境因素共同作用所致，即差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥-頂芒山羊草染色體系的分子標(biāo)記篩選

以中國(guó)春-頂芒山羊草雙二倍體為陽(yáng)性對(duì)照，以中國(guó)春、普通小麥品種Hobbit ‘sib’、濟(jì)麥22、濟(jì)麥23、濟(jì)麥229和濟(jì)麥262為陰性對(duì)照，以Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草異染色體系JIC-10、JIC-11、JIC-12和JIC-17為材料，篩選合成的IT引物，開(kāi)發(fā)頂芒山羊草M染色體特異分子標(biāo)記。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅染色體第二同源群的引物CINAU1060能同時(shí)在中國(guó)春-頂芒山羊草雙二倍體、Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草異染色體系JIC-10、JIC-11、JIC-12和JIC-17中擴(kuò)增出分子量為320 bp的多態(tài)性帶(圖1-A，表1)，而在陰性對(duì)照中擴(kuò)增不出這些多態(tài)性帶。以中國(guó)春、中國(guó)春-頂芒山羊草2M-7M附加系為材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)所獲標(biāo)記進(jìn)行染色體定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CINAU1060僅能在中國(guó)春-頂芒山羊草2M附加系中擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，說(shuō)明該標(biāo)記是頂芒山羊草2M特異標(biāo)記，表明JIC-10、JIC-11、JIC-12和JIC-17中均含2M染色質(zhì)(圖1-A)。

為了確證上述結(jié)論，用6個(gè)頂芒山羊草染色體臂2M特異PLUG標(biāo)記TNAC1138、TNAC1204、TNAC1137、TNAC1239、TNAC1206和TNAC1102(表1，*標(biāo)注)對(duì)上述供試材料進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JIC-10、JIC-11、JIC-12和JIC-17均能擴(kuò)增出上述6個(gè)標(biāo)記(表1)。其中，標(biāo)記1137/TaqI的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1-B。上述6個(gè)標(biāo)記中不僅有頂芒山羊草2MS染色體臂特異標(biāo)記，還有2ML染色體臂特異標(biāo)記，因此推斷JIC-10、JIC-11、JIC-12和JIC-17中均含2ML和2MS染色體或染色體片段。

2.2 小麥-頂芒山羊草染色體系的細(xì)胞學(xué)鑒定

2.2.1 小麥-頂芒山羊草染色體系背景小麥細(xì)胞學(xué)鑒定 以O(shè)ligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1為探針對(duì)小麥-頂芒山羊草染色體系的小麥背景材料Hobbit ‘sib’進(jìn)行熒光原位雜交分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Tang等[26]報(bào)道的中國(guó)春的信號(hào)相比，Hobbit ‘sib’在1D染色體短臂末端、5A長(zhǎng)臂中部、1B和6B隨體有Oligo-pTa119.2-1信號(hào)，而中國(guó)春在這些位置無(wú)相應(yīng)信號(hào)。中國(guó)春在染色體4A長(zhǎng)臂末端有Oligo-pTa119.2-1信號(hào)，5A長(zhǎng)臂中部有Oligo-pTa535-1信號(hào)，而Hobbit ‘sib’在4A長(zhǎng)臂末端和5A長(zhǎng)臂中部無(wú)相應(yīng)信號(hào)，其5B與7B之間發(fā)生羅伯遜易位形成5BS.7BS和5BL.7BL易位系(圖2-A)。

2.2.2 小麥-頂芒山羊草附加系和代換系的細(xì)胞學(xué)鑒定 以O(shè)ligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1為探針對(duì)Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草異染色體系JIC-10和JIC-11進(jìn)行雙色FISH分析，結(jié)果顯示，JIC-10含有44條染色體，其中，42條與親本Hobbit ‘sib’完全一致，另外1對(duì)染色體的雜交信號(hào)和長(zhǎng)短臂比例與已報(bào)道的頂芒山羊草2M染色體[30]完全相同(圖2-B)，因此，JIC-10是小麥-頂芒山羊草2M附加系。JIC-11含有42條染色體，其中40條染色體FISH信號(hào)與Hobbit ‘sib’完全相同，而1對(duì)2D染色體丟失，另外1對(duì)染色體的雜交信號(hào)和長(zhǎng)短臂比例與頂芒山羊草2M染色體[30]完全相同，因此，JIC-11是小麥-頂芒山羊草2M(2D)代換系。

2.2.3 小麥-頂芒山羊草易位系的分子細(xì)胞學(xué)鑒定 以O(shè)ligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1為探針對(duì)Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草異染色體系JIC-12進(jìn)行雙色FISH分析，結(jié)果顯示，該材料含有42條染色體，其中40條染色體信號(hào)與Hobbit ‘sib’完全相同，缺失1對(duì)2A染色體，另外1對(duì)染色體短臂信號(hào)與2MS信號(hào)一致，但長(zhǎng)臂的Oligo-pSc119.2-1信號(hào)丟失(圖2-C)。TNAC1204和TNAC1137等頂芒山羊草2ML長(zhǎng)臂特異標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果顯示，JIC-12能擴(kuò)增出2ML-0.27-0.94區(qū)段上的特異標(biāo)記。根據(jù)分子標(biāo)記結(jié)果、FISH雜交信號(hào)及染色體臂比信息，確定該染色體為2M染色體且2ML末端發(fā)生了染色體小片段丟失。引物TNAC1102(所在染色體位置為2AS5-0.78-1.00[24])對(duì) JIC-12的擴(kuò)增結(jié)果顯示，JIC-12可以擴(kuò)增出染色體2AS特異條帶，說(shuō)明JIC-12中含2AS染色質(zhì)，其2AS染色質(zhì)易位到2ML末端形成了2AS-2ML.2MS易位系(圖2-C，圖3)。

以O(shè)ligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1為探針對(duì)Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草異染色體系JIC-17進(jìn)行雙色FISH分析，結(jié)果顯示，該材料含有42對(duì)染色體，其中40條染色體信號(hào)與Hobbit ‘sib’完全相同，但缺失1對(duì)2D染色體，另外1對(duì)染色體短臂信號(hào)與2MS的信號(hào)一致，長(zhǎng)臂末端有很強(qiáng)的Oligo-pSc119.2-1信號(hào)，與染色體2ML末端信號(hào)不符(圖2-D)。利用引物TNAC1102和TNAC1137對(duì) JIC-17進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，兩對(duì)引物可在JIC-17中擴(kuò)出定位在2DS(2DS5-0.47-1.00)的條帶[24]，且TNAC1137在JIC-17中未能擴(kuò)增出定位在2DL的特異條帶[24]，表明JIC-17中含有2DS染色質(zhì)。根據(jù)分子標(biāo)記結(jié)果、FISH雜交信號(hào)及染色體臂比信息，確定2D短臂末端易位到染色體2M長(zhǎng)臂上形成了2DS-2ML.2MS易位系(圖2-D，圖3)。

伏于平原第四系或第三系之下，主要巖性為砂巖、砂礫巖，局部為熔巖。其中賦存風(fēng)化裂隙及孔隙裂隙承壓水。承壓水頭高度5.00 m，當(dāng)孔徑219 mm時(shí)單井涌水量為800.0 m3/d，單位涌水量為 9.26 L/（s·m）， 滲透系數(shù)1.81m/d。

2.3 小麥-頂芒山羊草染色體系的抗病抗逆性調(diào)查

以中國(guó)春和Hobbit ‘sib’為對(duì)照，對(duì)Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草2M附加系(JIC-10)、2M(2D)代換系(JIC-11)、2AS-2ML.2MS 易位系(JIC-12)和2DS-2ML.2MS易位系(JIC-17)進(jìn)行三銹病(條銹病、葉銹病、稈銹病)和白粉病抗病性鑒定，結(jié)果表明，所有供試材料均中感或高感葉銹病、稈銹病和白粉病(表2)。中國(guó)春和Hobbit ‘sib’高感條銹病，但小麥-頂芒山羊草2M染色體系均近免疫條銹病(表2)，表明頂芒山羊草2M染色體上含有抗條銹病基因。

表2 供試材料的抗病性調(diào)查結(jié)果Table 2 Investigation results of disease resistance of the materials tested

2.4 小麥-頂芒山羊草染色體系的農(nóng)藝性狀調(diào)查

以親本Hobbit ‘sib’為對(duì)照，對(duì)Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草2M附加系(JIC-10)、2M(2D)代換系(JIC-11)、2AS-2ML.2MS 易位系(JIC-12)和2DS-2ML.2MS易位系(JIC-17)在四地(德州、菏澤、濟(jì)南和臨沂)的株高、穗長(zhǎng)、旗葉長(zhǎng)、旗葉寬、分蘗數(shù)和小穗數(shù)等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查，方差分析結(jié)果表明，與Hobbit ‘sib’相比，2M染色體的導(dǎo)入對(duì)小麥株高(圖4-A)、穗長(zhǎng)(圖4-B)、旗葉長(zhǎng)(圖4-C)、分蘗數(shù)(圖4-E)和穗粒數(shù)(圖5-A)均無(wú)顯著影響。

小麥-頂芒山羊草2M附加系、2M(2D)代換系和2DS-2ML.2MS易位系的旗葉寬與對(duì)照Hobbit ‘sib’相比，差異不顯著，但小麥-頂芒山羊草2AS-2ML.2MS易位系的旗葉寬較對(duì)照極顯著變窄(圖4-D)，這可能是2M染色體導(dǎo)入與小麥2AL染色體丟失共同作用的結(jié)果。供試材料的小穗數(shù)(圖4-F)較Hobbit ‘sib’均顯著或極顯著變少(僅德州小麥-頂芒山羊草2M附加系和2DS-2ML.2MS易位系除外)，說(shuō)明2M染色體導(dǎo)入可能導(dǎo)致小穗數(shù)變少。

由圖5-A可知，與對(duì)照Hobbit ‘sib’相比，Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草2M附加系、Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草2AS-2ML.2MS易位系和2DS-2ML.2MS易位系的30穗穗粒數(shù)顯著減少，表明頂芒山羊草2M染色體導(dǎo)入是導(dǎo)致小麥穗粒數(shù)減少的原因。2M(2D)代換系的30穗穗粒數(shù)與Hobbit ‘sib’差異不顯著，可能是小麥2D染色體的丟失減輕了頂芒山羊草2M染色體導(dǎo)入對(duì)小麥穗粒數(shù)產(chǎn)生的負(fù)效應(yīng)。由圖5-B可知，與對(duì)照Hobbit ‘sib’ 相比，小麥Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草2M附加系、2M(2D)代換系、2AS-2ML.2MS易位系和2DS-2ML.2MS易位系的30穗穗粒重均顯著降低(圖5-B)，說(shuō)明2M染色體的導(dǎo)入是小麥穗粒重降低的主要原因。

3 討論

在山羊草屬物種分子標(biāo)記建立方面，劉旭等[31]利用132條隨機(jī)引物對(duì)高大山羊草及對(duì)照進(jìn)行分析，建立了7個(gè)高大山羊草基因組RAPD 標(biāo)記；吳紅坡等[32]選取400對(duì)小麥SSR引物對(duì)卵穗山羊草以及小麥-卵穗山羊草衍生后代進(jìn)行篩選，獲得10個(gè)卵穗山羊草特異SSR標(biāo)記；Gong等[21,33]先后篩選PLUG引物、EST-STS引物、SSR引物和COS引物，分別建立了42、55個(gè)單芒山羊草和尾狀山羊草基因組分子標(biāo)記；翁躍進(jìn)等[34]利用29個(gè)小麥探針和6種限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)頂芒山羊草M染色體組進(jìn)行RFLP分析，獲得40個(gè)RFLP分子標(biāo)記；Liu等[23]利用PLUG引物對(duì)頂芒山羊草染色體組分子標(biāo)記進(jìn)行開(kāi)發(fā)，獲得47個(gè)染色體特異標(biāo)記，其中7個(gè)2M染色體特異標(biāo)記。近期，基于簇毛麥基因內(nèi)含子序列的IT分子標(biāo)記已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)[22]。但利用IT引物對(duì)山羊草標(biāo)記的報(bào)道較少。本研究以Hobbit ‘sib’為對(duì)照，以含頂芒山羊草染色質(zhì)的材料為基礎(chǔ)對(duì)這批來(lái)自簇毛麥的分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，獲得1個(gè)頂芒山羊草2M染色體特異標(biāo)記，為檢測(cè)小麥背景中頂芒山羊草2M染色質(zhì)提供了新的方法。但本研究篩選IT引物獲得染色體第二同源群標(biāo)記的效率僅為1.1%，低于文獻(xiàn)[23,32-34]獲得標(biāo)記的效率，這可能是由于用瓊脂糖進(jìn)行電泳而未用分辨率較高的聚丙烯酰氨凝膠進(jìn)行電泳造成的。

在小麥-頂芒山羊草染色體系創(chuàng)制與鑒定方面，自上世紀(jì)60年代至今，僅英國(guó)和中國(guó)科學(xué)家開(kāi)展了利用頂芒山羊草進(jìn)行小麥遺傳改良的研究[3,35-36]。Riley等[3,35]最早將頂芒山羊草的抗病基因Sr34和Yr8轉(zhuǎn)移到小麥中，獲得了小麥-頂芒山羊草2M附加系、2DL/2M和2DS/2M易位系；1997年我國(guó)翁躍進(jìn)等[6,36]利用花藥培養(yǎng)創(chuàng)造小麥-頂芒山羊草異源附加系并利用RFLP標(biāo)記從小麥-頂芒山羊草雜交后代中篩選出了4M(4D)代換系。Nasuda等[37]利用C帶和基因組原位雜交鑒定出了小麥-頂芒山羊草易位系T2AS-2M#1L.2M#1S和T2DS-2M#1L.2M#1S；Liu等[23]從中國(guó)春-頂芒山羊草雜交種質(zhì)中鑒定出了中國(guó)春-頂芒山羊草2M-7M附加系和6M(6A)代換系。本研究對(duì)Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草雜交種質(zhì)進(jìn)行鑒定，從中鑒定了Hobbit ‘sib’-頂芒山羊草2M附加系、2M(2D)代換系、2AS-2ML.2MS易位系和2DS-2ML.2MS易位系。因?yàn)楸狙芯克b定材料和Nasuda等[37]鑒定的小麥-頂芒山羊草#1染色體系均源自英國(guó)John Innes Centre，且其小麥背景都是Hobbit ‘sib’，所以，本研究鑒定的2AS-2ML.2MS易位系和2DS-2ML.2MS易位系即小麥-頂芒山羊草易位系T2AS-2M#1L.2M#1S易位系和T2DS-2M#1L.2M#1S。本研究建立的2M染色體IT標(biāo)記與Liu等[23]建立的PLUG標(biāo)記和頂芒山羊草FISH核型，以及Nasuda等[37]建立的RFLP標(biāo)記結(jié)果能夠相互印證，這表明上述分子與細(xì)胞遺傳方法在鑒定小麥-頂芒山羊草種質(zhì)方面都是準(zhǔn)確的。

條銹病是影響小麥最嚴(yán)重全球性病害之一，目前，已報(bào)道的抗條銹病基因有200余個(gè)，被正式命名的有80個(gè)[38-39]。來(lái)源于山羊草屬的抗條銹病基因有7個(gè)，其中Yr8來(lái)源于頂芒山羊草[3]，Yr17來(lái)源于偏凸山羊草[40]，Yr28來(lái)源于粗山羊[41]，Yr37來(lái)源于粘果山羊草[42]，Yr38來(lái)源于沙融山羊草[43]，Yr40來(lái)源于卵穗山羊草[44]，Yr42來(lái)源于短柄山羊草[45]。來(lái)源于頂芒山羊草的Yr8是Riley等[3]利用遺傳誘導(dǎo)同源重組技術(shù)導(dǎo)入小麥的。然而，Wan等[46]發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)χ袊?guó)條銹菌生理小種已經(jīng)失去抗性。本研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自2M染色體上的抗條銹病基因?qū)l銹菌CYR32、CYR33和Su34混合生理小種具有良好抗性，推測(cè)2M染色體上存在新的抗條銹病基因。

李桂萍等[16]對(duì)小麥-簇毛麥6VS.6AL易位系的F2群體和高代品系的產(chǎn)量、株高、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)6VS.6AL對(duì)小麥穗長(zhǎng)和千粒重有一定的正向效應(yīng)，對(duì)其他農(nóng)藝性狀無(wú)明顯影響。李俊等[47]發(fā)現(xiàn)小麥-黑麥1RS-7DS.7DL易位系對(duì)小麥農(nóng)藝性狀中千粒重?zé)o負(fù)作用；任天恒等[48]發(fā)現(xiàn)以白粒黑麥為供體育成的1RS.1BL易位系T956-13可以提高小麥千粒重和穗數(shù)從而達(dá)到提高產(chǎn)量的目的。本研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入頂芒山羊草2M染色體對(duì)小麥株高、穗長(zhǎng)、旗葉長(zhǎng)、旗葉寬和分蘗數(shù)未產(chǎn)生顯著影響，對(duì)小穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重可能產(chǎn)生顯著負(fù)效應(yīng)。因此，在利用頂芒山羊草2M染色體上的抗條銹病基因的小片段易位系時(shí)，應(yīng)加大對(duì)誘導(dǎo)群體的選擇，并適當(dāng)利用當(dāng)前主栽小麥對(duì)其進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育。

4 結(jié)論

本研究鑒定的小麥-頂芒山羊草染色體系分別是小麥-頂芒山羊草2M附加系、2M(2D)代換系、2AS-2ML.2MS易位系和2DS-2ML.2MS易位系，對(duì)當(dāng)前條銹菌流行小種CYR32、CYR33和Su-4具有良好抗性。頂芒山羊草2M染色體上可能含有不同于Yr8的抗條銹病新基因，值得利用染色體工程對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)以應(yīng)用于小麥抗病育種，但2M染色體導(dǎo)入可對(duì)小麥產(chǎn)量性狀的形成產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)，因此，在創(chuàng)制、篩選和利用抗病染色體小片段易位系時(shí)應(yīng)注意對(duì)其負(fù)效應(yīng)進(jìn)行剔除。本研究鑒定出的抗條銹病小麥-頂芒山羊草2M染色體系豐富了小麥抗病基因庫(kù)，為小麥育種提供了新抗源；為小麥-頂芒山羊草2M染色體系的綜合評(píng)價(jià)，以及材料的后續(xù)開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

致謝：感謝河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院閆紅飛教授和沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院李天亞教授在試驗(yàn)材料葉銹病和稈銹病鑒定方面給予的幫助。感謝德州農(nóng)科院劉鵬研究員、臨沂農(nóng)科院李寶強(qiáng)研究員、菏澤農(nóng)科院郭鳳芝研究員在試驗(yàn)材料種植、管理和農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)方面給予的幫助。