史明偉 潘 鴻 顏佳寧 金奇江 王彥杰 徐迎春,*

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部景觀設(shè)計重點實驗室，江蘇 南京 210095；2 南京水一方文化旅游發(fā)展有限公司，江蘇 南京 210058)

睡蓮是睡蓮科(Nymphaeaceae)睡蓮屬(Nymphaea)植物的通稱，該屬有50多個種(含變種)，依形態(tài)特征可分為5個亞屬，分別為耐寒睡蓮亞屬、廣熱帶睡蓮亞屬、古熱帶睡蓮亞屬、新熱帶睡蓮亞屬和澳洲睡蓮亞屬[1]。睡蓮是重要的水生花卉和世界名花，花色豐富，花期長，易栽培，在城鄉(xiāng)的公共綠地水體綠化、美化與凈化中發(fā)揮著重要作用[2]。睡蓮的栽培、育種和應(yīng)用在全球范圍內(nèi)受到廣泛關(guān)注[3]，育種目標(biāo)主要以獨特的花色為主。目前睡蓮新品種大多數(shù)都是通過人工雜交和自然雜交培育，結(jié)果隨機性較強。因此，對睡蓮開展新的育種手段研究十分重要。

輻射誘變具有突變頻率高、突變譜廣、育種年限短等優(yōu)點，能誘發(fā)產(chǎn)生自然界罕見或應(yīng)用一般常用方法難以獲得的新性狀[4]，并且能改善種子的萌發(fā)[5]，促進(jìn)植物的生長和開花[6]。輻射育種已被廣泛運用于觀賞植物新品種的選育，如林兵等[7]研究表明60Co-γ輻射處理能誘導(dǎo)出白色和紫色的荷蘭鳶尾；臺德強等[8]以不同劑量的60Co-γ射線對3種變色葉類觀賞海棠進(jìn)行輻射處理，不僅能改變?nèi)~片與花瓣的形態(tài)，還能改變其色澤。此外，傅巧娟等[9]、李樹舉等[10]和陳秀蘭等[11]均通過60Co-γ射線選育出不同植物的新品種。

目前，國內(nèi)外鮮見關(guān)于睡蓮輻射誘變的研究，張啟明等[12]對睡蓮N. Colorado植株進(jìn)行了不同劑量的電子束輻射處理，發(fā)現(xiàn)電子束輻射可引起睡蓮花量減少、花色改變，并誘發(fā)DNA產(chǎn)生變異。而60Co-γ射線在睡蓮育種中的應(yīng)用鮮見報道，因此開展60Co-γ射線輻射睡蓮的研究，對培育睡蓮新品種具有重要的意義。為此，本試驗選取耐寒睡蓮弗吉尼亞(N. Virginia)和奧毛斯特(N. Almost black)為試驗材料，用不同劑量的60Co-γ射線進(jìn)行輻射處理，研究其生物學(xué)效應(yīng)，以期為進(jìn)一步選育睡蓮新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為2個耐寒睡蓮品種，分別為花色為白色的弗吉尼亞和暗紅色的奧毛斯特，由南京藝蓮苑花卉有限公司提供。

1.2 試驗方法

于2018年4月，在上海束能輻射技術(shù)有限公司對睡蓮塊莖進(jìn)行60Co-γ射線輻射處理，輻射劑量率為1 Gy·min-1。 分別設(shè)置0(CK)、5、10、15、20、30、40、50 Gy 8個處理，每處理各輻射20株。輻射處理后，將睡蓮塊莖種植于口徑為380 mm的盆內(nèi)，并套上口徑為535 mm 的大盆，置于室外進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，日平均氣溫約為20℃。

1.3 睡蓮生物學(xué)指標(biāo)測定

睡蓮塊莖移栽1個月后統(tǒng)計存活數(shù)，并以輻射劑量為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)作擬合直線回歸方程Y=a+bX，計算半致死劑量(LD50)，并于盛花期觀測睡蓮浮葉數(shù)、花徑、葉面積、開花時間以及變異情況。

存活率=(成活數(shù)/種植數(shù))×100%

(1)

開花率=(開花株數(shù)/存活數(shù))×100%

(2)

葉片變異率=(葉片變異株數(shù)/存活數(shù))×100%

(3)

花部變異率=(花部變異株數(shù)/存活數(shù))×100%

(4)

花期延遲天數(shù)(d)=試驗組第一朵花開時間-對照組第一朵花開時間

(5)

花期(d)=最后一朵花謝的時間-第一朵花開的時間

(6)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Office Excel 2017和SPSS 21. 0 對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 60 Co-γ射線輻射對睡蓮存活率的影響

由表1可知，不同劑量60Co-γ輻射處理對2個睡蓮品種的存活率均產(chǎn)生了影響，且存活率均隨著輻射劑量的增加而降低。對照組弗吉尼亞、奧毛斯特的存活率分別為100%、95%；輻射劑量為5～20 Gy時2個睡蓮品種的存活率略有下降；輻射劑量為30 Gy時，弗吉尼亞、奧毛斯特的存活率分別急劇下降至30%和45%；繼續(xù)增大輻射劑量，2個睡蓮品種的存活率持續(xù)下降，當(dāng)輻射劑量為50 Gy時，2個睡蓮品種均無法存活(存活率為0)。分別對2個睡蓮品種的存活率和輻射劑量進(jìn)行線性回歸分析，得出弗吉尼亞的半致死劑量為24.342 Gy，奧毛斯特的半致死劑量為27.671 Gy。

表1 60 Co-γ射線輻射對睡蓮存活率的影響Table 1 Effect of 60Co-γ irradiation treatment on the survival rate of water lily /%

2.2 60 Co-γ射線輻射對睡蓮開花時間的影響

由表2可知，經(jīng)60Co-γ射線輻射處理后，2個睡蓮品種的初始開花時間均隨著輻射劑量的增加而延后。其中，與CK相比，5～15 Gy輻射處理下弗吉尼亞的開花時間顯著延后，但各處理組間無顯著差異；輻射劑量為20 Gy時，弗吉尼亞的開花時間顯著推遲19 d，而輻射劑量為30、40 Gy時開花時間延后程度更大，分別顯著延長至59 和61 d；輻射劑量為50 Gy時，弗吉尼亞未能開花。經(jīng)60Co-γ射線輻射處理后，奧毛斯特的初始花期變化趨勢與弗吉尼亞一致，但輻射劑量為40 Gy時，奧毛斯特就未能開花。總花期方面，在低劑量(5～20 Gy)輻射處理下，2個睡蓮品種所受影響不明顯，但在高劑量(30～40 Gy)輻射處理下，睡蓮花期受到顯著影響，花期極短，僅有3～4 d。由此可見，輻射處理推遲了2個睡蓮品種的開花時間，且輻射劑量越高，開花越晚；而對整個花期時間并無明顯影響。

2.3 60 Co-γ射線輻射對睡蓮浮葉數(shù)和葉面積的影響

由圖1-A可知，輻射處理對2個睡蓮品種的葉面積均有影響，低劑量輻射處理(5～10 Gy)時，睡蓮葉面積均顯著大于CK，且在輻射劑量為5 Gy時葉面積達(dá)到最大，說明低劑量輻射處理能夠促進(jìn)睡蓮葉片的生長；高劑量輻射處理(20～40 Gy)時，2個睡蓮品種的葉面積均隨著輻射劑量的增加而顯著降低，說明高劑量輻射處理能有效抑制睡蓮葉片的生長。

表2 60 Co-γ射線輻射對睡蓮開花時間的影響Table 2 Effect of 60Co-γ irradiation on flowering time of water lily /d

由圖1-B可知，隨著輻射劑量的增加，2個睡蓮品種的浮葉數(shù)與葉面積呈相同趨勢，在低劑量(5～10 Gy)輻射處理時浮葉數(shù)較CK增加，但無顯著差異；高劑量(20～40 Gy)輻射處理時，隨著輻射劑量增加睡蓮浮葉數(shù)逐漸減少，其中，當(dāng)輻射劑量為30～40 Gy時，睡蓮浮葉數(shù)顯著少于其他處理組。

注：不同小寫字母表示同一品種不同輻射劑量處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences between difference irradiation treatment at the same cultivar (P< 0.05). The same as following.圖1 60 Co-γ射線輻射對睡蓮葉面積(A)、浮葉數(shù)(B)的影響Fig.1 Effects of 60 Co-γ irradiation treatment on leaf area(A)and floating leaf number(B)of water lily

2.4 60 Co-γ射線輻射對睡蓮開花率和花徑的影響

由圖2-A可知，2個睡蓮品種的開花率呈現(xiàn)相同的變化趨勢，均隨著輻射劑量的增加而降低。CK中2個睡蓮品種的開花率均達(dá)到了100%；輻射劑量為5～15 Gy時，睡蓮開花率與CK相比差異不顯著；輻射劑量為20～40 Gy時，睡蓮開花率顯著低于CK，表明高劑量輻射處理對2個睡蓮品種的開花率有顯著抑制作用。

由圖2-B可知，未經(jīng)輻射處理(CK)時，弗吉尼亞和奧毛斯特的花徑分別為11.23、12.97 cm，經(jīng)輻射處理后，隨著輻射劑量的增加，睡蓮花徑呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢。當(dāng)輻射劑量為5 Gy時，2個睡蓮品種的花徑均增大，但與CK相比無顯著差異；當(dāng)輻射劑量為10～20 Gy時，睡蓮花徑均顯著減小，但處理組間無顯著差異；當(dāng)輻射劑量為30～40 Gy時，睡蓮花徑進(jìn)一步減小。由此可見，較高劑量60Co-γ輻射處理顯著抑制了睡蓮花徑的生長。

2.5 60 Co-γ射線輻射后睡蓮葉片的變異情況

由表3可知，輻射處理后2個睡蓮品種的葉片變異率均很高，且變異率隨著輻射劑量的增加而升高。經(jīng)輻射處理后，2個睡蓮品種的葉片均發(fā)生了較多類型的變異，且變異性狀相似。由圖3可知，2個睡蓮品種的葉片均出現(xiàn)了紅棕色斑塊，且隨著輻射劑量的增加，紅棕色面積逐漸擴大。此外，還發(fā)生了較多類型的畸變(圖4)，變異葉片出現(xiàn)的類型有：葉片葉緣不規(guī)則(圖4-A1、B4、B5)，葉片半邊葉緣出現(xiàn)鋸齒(圖4-A6、B7)，葉片兩邊葉緣出現(xiàn)鋸齒(圖4-A7)；葉片有兩處缺刻(圖4-A3、A5、B6)，葉片有孔(圖4-A10)，葉片皺縮(圖4-A9、B8)，葉片卷曲(圖4-A12、B9、B12)，葉片重疊(圖4-A3、B6)；葉片有黃色斑塊(圖4-A2、B2、B3)、葉片有粉色斑塊(圖4-B11)，且輻射劑量越高，睡蓮葉片出現(xiàn)的變異類型越多。

表3 60Co-γ射線輻射后睡蓮葉片的變異率Table 3 Variation rate of water lily leaf after 60Co-γ irradiation treatment /%

2.6 60 Co-γ射線輻射后睡蓮花朵的變異情況

由表4可知，奧毛斯特花部性狀的變化率遠(yuǎn)高于弗吉尼亞，在輻射劑量為5 Gy時，接近一半的植株的花出現(xiàn)變異，且隨輻射劑量的增加，變異率逐漸升高，輻射劑量至30 Gy時，所有處理植株的花均發(fā)生變異。而弗吉尼亞僅在30 Gy處理時開始出現(xiàn)較高的變異率。

由圖5可知，輻射處理對白色花的弗吉尼亞花部的影響不大，變異率較低，僅發(fā)生2例變異(圖5-B、C)，表現(xiàn)為變異花瓣不能完全展開、花徑小、花瓣少、萼片少且部分變短等特征。而輻射處理對奧毛斯特花部有顯著影響，變異率較高，尤其在花色上。正常奧毛斯特的花(圖5-D)為暗紅色，內(nèi)部花瓣近墨黑色，經(jīng)過輻射處理的花朵發(fā)生了不同程度的褪色現(xiàn)象，花色出現(xiàn)了粉色(圖5-F)、淡粉色(圖5-G)和白色(圖5-H)。奧毛斯特還出現(xiàn)了一朵橙色花(圖5-Ⅰ)以及花瓣一半變白的變異性狀(圖5-L)。此外還發(fā)現(xiàn)了花型變異的花朵(圖5-K)，花朵部分萼片變短，與弗吉尼亞(圖5-B、C)類似，變異花有3個長萼片，構(gòu)成三角花型。

注：A：弗吉尼亞；B：奧毛斯特。Note: A: N. Virginia. B: N. Almost black.圖3 60 Co-γ 射線輻射處理后2個睡蓮品種葉片紅棕色變異情況Fig.3 Variation of red-brown leaves of two cultivars of water lily treated by 60Co-γ irradiation

注：A：弗吉尼亞；B：奧毛斯特。Note: A: N. Viriginia. B: N. Almost black.圖4 60Co-γ 射線輻射后2個睡蓮品種葉片形態(tài)的變異情況Fig.4 Variation of leaves morphology of water lily treated by 60 Co-γ irradiation

表4 60 Co-γ輻射后睡蓮花部的變異率Table 4 Variation rate of water lily flowers after 60Co-γ irradiation treatment /%

注：A～C為弗吉尼亞，其中A為未進(jìn)行輻射處理的對照株，B和C為輻射處理的變異株；D～L為奧毛斯特，其中D為對照株，E～L為輻射處理的變異株。Note: A to C are N. Virginia, A is control plant no-treated by irradiation, B and C are variation plant treated by irradiation; D to L are N. Almost black, D is control, E to L are variation plant treated by irradiation.圖5 60Co-γ射線輻射后2個睡蓮品種花部性狀的變異情況Fig.5 Effects of 60Co-γ irradiation treatments on the flower characters of water lily

3 討論

本研究中，60Co-γ射線輻射處理顯著影響睡蓮的成活率，且睡蓮的成活率隨著輻射劑量的增加而下降，這與荷花[13]、德國鳶尾[14]和蘋果[15]等的研究結(jié)果一致。LD50常作為適宜的誘變劑量指導(dǎo)輻射育種，不同植物的LD50存在差異。余蓉培等[16]采用60Co-γ射線對波士頓蕨綠色球狀體進(jìn)行輻射處理，得到LD50為128 Gy；周亞倩等[17]得到樹蘭蒴果60Co-γ射線的LD50為78.08 Gy；何嶺等[18]以不同劑量60Co-γ 射線輻射處理海州常山一年生根蘗苗，得出海州常山根蘗苗的LD50為41.07 Gy。而本研究中，弗吉尼亞的LD50為24.342 Gy，奧毛斯特的LD50為27.671 Gy，較前人的結(jié)果偏低，這可能與睡蓮塊莖上的休眠芽對60Co-γ射線比較敏感有關(guān)。

通常認(rèn)為60Co-γ射線輻射對植物生長發(fā)育的影響表現(xiàn)為低劑量促進(jìn)高劑量抑制[19]，Kim等[20]研究發(fā)現(xiàn)低劑量(1～2 Gy)60Co-γ射線輻射處理輕微促進(jìn)擬南芥幼苗苗高的生長，而高劑量(大于50 Gy)輻射處理則顯著抑制幼苗生長。在本研究中，低劑量(5～10 Gy)輻射處理促進(jìn)睡蓮葉片的生長，使睡蓮葉面積和浮葉數(shù)顯著增加；高劑量(20～40 Gy)輻射處理有效抑制了睡蓮葉片的生長，顯著減少了睡蓮葉面積和浮葉數(shù)，這與前人的研究結(jié)果一致。

本研究中，60Co-γ射線輻射處理對睡蓮的開花時間也有顯著影響，2個睡蓮品種的開花時間均隨著輻射劑量的增加而延遲，在低劑量(5～15 Gy)輻射處理時，睡蓮初花期與CK相比延遲了3～9 d，高劑量(20～40 Gy)輻射處理則嚴(yán)重延遲了開花時間，但整個花期時間長度無顯著變化，這與陳秀蘭等[11]和任少雄等[21]的研究結(jié)果吻合。此外，劉春貴等[22]采用60Co-γ射線輻射處理鳶尾，發(fā)現(xiàn)200 Gy輻射劑量對多數(shù)鳶尾品種的花徑有抑制作用；趙興華等[23]以60Co-γ射線輻射處理3種切花百合鱗莖，發(fā)現(xiàn)輻射處理顯著降低了百合植株的開花率。而本研究中，輻射劑量為10～40 Gy時，睡蓮花徑顯著減??；輻射劑量為10～40 Gy時，睡蓮的開花率隨輻射劑量的增加而降低，這與前人的研究結(jié)果一致。

在其他植物輻射變異性狀的研究中，輻射處理的植物葉片會出現(xiàn)花葉、條紋葉以及畸形葉等性狀[24]。本研究中，經(jīng)60Co-γ射線輻射處理后的睡蓮葉片出現(xiàn)鋸齒、皺縮、小孔、卷曲、黃化等變異性狀，這與前人的研究有一定的相似。諸多研究表明，在一定范圍內(nèi)，隨著輻射劑量的增加，輻射損傷越明顯，后代出現(xiàn)的變異也隨之增加[25-26]。本研究中，隨著輻射劑量的增加，睡蓮葉片出現(xiàn)紅棕色斑塊的面積增大，同時，葉片出現(xiàn)的變異類型增多，表明高劑量輻射處理可以用來培育具有特殊葉色的睡蓮新品種。

60Co-γ射線輻射處理后，植物花瓣會出現(xiàn)畸形和褪色、金黃色線條相嵌、白色斑點狀花紋等變異性狀[7]。包建忠等[27]研究發(fā)現(xiàn)輻射對觀賞荷花的花色有一定的影響，紅色系和復(fù)色系品種易產(chǎn)生誘變，大多由原來的粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榈凵蚣t白瓣，白色系品種未發(fā)現(xiàn)變異性狀；郭安熙等[28]通過輻射處理不同菊花品種表明，綠花、白花、黃花品種誘發(fā)花色變異的頻率極低，而粉紫色品種較易誘發(fā)花色變異。在本研究中，白色的弗吉尼亞花色未發(fā)生變異，暗紅色的奧毛斯特花色發(fā)生了變異，花色由暗紅色褪色為粉色、淡粉色和白色，這與前人的研究結(jié)果一致，因此，輻射誘變睡蓮時，推薦選用花色艷麗的品種為輻射材料。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，輻射處理能造成睡蓮花型發(fā)生變異，2個睡蓮品種均發(fā)現(xiàn)了花型變異的現(xiàn)象，這在觀賞植物輻射誘變研究中還未見報道。在單盆睡蓮中，只有先開的幾朵花的花色發(fā)生了變異，之后開的花并未發(fā)生變異，這可能是由于輻射室內(nèi)空間劑量分布不均勻，也有可能是睡蓮塊莖體積大，輻射時未接受到均勻的劑量。研究表明，60Co-γ射線造成的變異性狀，在下一代栽培中，有時不能穩(wěn)定保持[7,29]，而本研究只探討了輻射對VM1代的表型變異，變異性狀能否在VM2及以后世代中穩(wěn)定表達(dá)，還需進(jìn)一步的觀察與鑒定。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，60Co-γ射線輻射處理睡蓮塊莖的適宜劑量為20～30 Gy；白色睡蓮品種可以用來培育葉色新品種，紅色睡蓮品種既可以用來培育葉色新品種，也能用來培育花色新品種；60Co-γ射線不僅可用于選育微型、小花睡蓮品種，而且可用于調(diào)控睡蓮的花期。本研究結(jié)果為輻射誘變選育不同用途的睡蓮新品種奠定了基礎(chǔ)。