孟 迪 景金珠 王 瑩 梁 震

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)為常見的慢性退行性疾病，多發(fā)于中老年人，病變累及整個關(guān)節(jié)，危害嚴(yán)重，目前臨床上尚無有效的治療手段[1]。近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)為OA治療帶來曙光，研究證實其可有效修復(fù)OA軟骨損傷[2]。但是，MSCs治療存在致瘤性、異常堆積等諸多亟待解決的問題，限制了其臨床應(yīng)用。研究表明，MSC的治療效果主要來自于外泌體(exosome)介導(dǎo)的旁分泌途徑[2～4]。MSCs分泌的exosome(MSC-Exo)存在與其來源親本干細(xì)胞類似的功能，且與MSC治療比較，具有更加簡便、安全、穩(wěn)定等優(yōu)勢[4,5]。最新研究結(jié)果顯示，MSC-Exo可促進(jìn)OA關(guān)節(jié)軟骨再生，但相關(guān)機(jī)制尚不明確[6～9]。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)唯一的細(xì)胞成分，因此本研究以軟骨細(xì)胞為研究對象，檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體(BMSC-Exo)對軟骨細(xì)胞遷移、增殖和凋亡的影響，初步探索BMSC-Exo修復(fù)OA關(guān)節(jié)軟骨損傷的機(jī)制，為OA的臨床防治提供更為廣闊的思路，為探索新型“無細(xì)胞”治療方法奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料：(1)實驗動物：SPF級SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2013-0011]。(2)主要儀器：恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；低溫離心機(jī)(美國Sigma公司)；超速離心機(jī)(美國Beckman公司)；透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。(3)主要試劑：α-MEM、低糖DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；澳洲胎牛血清(美國Gibco公司)；0.25%胰酶(美國Life Technologies公司)；Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)；無外泌體血清、anti-CD63抗體、anti-CD81抗體、anti-Tsg101及二抗(美國System Biosciences公司)；IL-1β(美國PeproTech公司)；SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(中國賽業(yè)公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、CCK-8試劑盒(中國碧云天公司)。

2.BMSC的分離與培養(yǎng)：6～8周齡雄性SD大鼠，處死后于無菌條件下分離股骨和脛骨，剪斷兩端干骺端，用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔直至變白，收集沖洗液并吹打成單細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，棄去上清，加入適量含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24～48h后更換培養(yǎng)基以去除未貼壁細(xì)胞，之后每2天換液1次，至細(xì)胞密度80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代。使用第3～5代細(xì)胞用于實驗。

3.BMSC多向分化能力鑒定：(1)成骨誘導(dǎo)分化：取第3代BMSC，使用SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒，按照說明書步驟進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)3周后進(jìn)行茜素紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。(2)成脂誘導(dǎo)分化：取第3代BMSC，使用SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒，按照說明書步驟進(jìn)行誘導(dǎo)分化，待脂滴變得足夠大、圓，進(jìn)行油紅O染色，光學(xué)顯微鏡下觀察成脂染色效果。

4.軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：1周齡左右SD大鼠，處死后于無菌條件下游離雙側(cè)后肢，削取股骨髁、膝關(guān)節(jié)表面軟骨并剪碎至1mm3大小，充分漂洗，0.25%胰蛋白酶37℃搖蕩消化30min，然后按體積比1∶5加入0.2%(2g/L)Ⅱ型膠原酶，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化4h。消化后將細(xì)胞懸液通過200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，1000r/min離心5min，棄去上清，加入適量含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，之后每2天換液1次，至細(xì)胞密度約90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代。通過形態(tài)學(xué)觀察和甲苯胺藍(lán)染色鑒定分離的軟骨細(xì)胞。使用第3～5代細(xì)胞用于實驗。

5.外泌體的提?。喝〉?～5代大鼠BMSC，使用含無外泌體FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞上清，300g離心10min，然后收集上清，2000g離心10min，再次收集上清，0.22μm濾器過濾后轉(zhuǎn)移到濾膜孔徑為100kDa NWCO的超濾離心管，4000g離心30～50min濃縮上清液。收集濃縮液，10000g離心30min。上清轉(zhuǎn)移至超速離心管，100000g離心70min，2次。得到的沉淀即為外泌體，加入適量PBS重懸，-80℃保存?zhèn)溆?。BCA試劑盒測定外泌體蛋白濃度。

6.外泌體形態(tài)的鑒定：采用透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)。將載樣銅網(wǎng)置于濾紙上，滴加20μl外泌體提取液，室溫靜置3min。濾紙吸干銅網(wǎng)側(cè)邊液體，加入30μl 3%磷鎢酸溶液，室溫負(fù)染5min。將銅網(wǎng)置于樣品室，觀察外泌體形態(tài)并拍照。

7.外泌體表面標(biāo)志物的鑒定：Western blot法檢測外泌體特異性表面標(biāo)志物CD63、CD81和Tsg101的表達(dá)。提取外泌體，RIPA裂解液裂解后BCA法測定蛋白濃度。按照50微克/孔上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。然后PVDF膜依次經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1h，anti-CD64、anti-CD81、anti-Tsg101、anti-β-actin抗體4℃過夜孵育，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育30min，最后用ECL發(fā)光液顯影曝光。去除外泌體的細(xì)胞培養(yǎng)基(BMSC-Ed-CM)作為對照。

8.細(xì)胞遷移的檢測：劃痕實驗檢測軟骨細(xì)胞的遷移能力。6孔板背面畫線，接種軟骨細(xì)胞，密度以過夜長滿為宜。細(xì)胞長滿后用200μl無菌槍頭垂直于畫的線進(jìn)行劃痕，PBS洗去懸浮細(xì)胞，CM組(細(xì)胞培養(yǎng)基對照組)加入含1%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基，Exo組分別加入終濃度為25、50和100μg/ml的外泌體，為模擬OA病理環(huán)境，同時設(shè)置IL-1β(10ng/ml)對照組，各組分別于0、12和24h進(jìn)行顯微拍照，使用Image J軟件分析劃痕愈合率。

9.細(xì)胞增殖的檢測：CCK-8試劑盒檢測軟骨細(xì)胞的增殖。軟骨細(xì)胞按2×103個/孔的密度接種96孔板，次日每組加入對應(yīng)的完全培養(yǎng)基(實驗分組同前)，繼續(xù)培養(yǎng)1、3、5和7天。作用結(jié)束后每孔加入10μl CCK-8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2h，使用酶標(biāo)儀在450nm測定吸光度。

10.細(xì)胞凋亡的檢測：流式細(xì)胞術(shù)檢測軟骨細(xì)胞的凋亡。軟骨細(xì)胞接種6孔板，待細(xì)胞密度約80%時，每組加入對應(yīng)的完全培養(yǎng)基(實驗分組同前)，繼續(xù)培養(yǎng)24和48h后收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書步驟操作進(jìn)行Annexin Ⅴ-FITC和PI染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

結(jié) 果

1.細(xì)胞分離與鑒定：分離的原代軟骨細(xì)胞呈多角形或短梭形，折光性強(qiáng)，密度高時呈“鋪路石”樣，甲苯胺藍(lán)染色呈陽性。貼壁后的大鼠BMSC呈梭形，渦旋狀生長。通過干細(xì)胞多向分化能力實驗鑒定分離的BMSC，結(jié)果如圖1所示。成骨誘導(dǎo)后BMSC內(nèi)逐漸出現(xiàn)鈣質(zhì)沉積，第21天用茜素紅染色可見紅色致密結(jié)節(jié)(圖1A)。成脂誘導(dǎo)后BMSC逐漸由梭形變?yōu)閳A形，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小脂滴，且脂滴逐漸融合變大，第14天油紅O染色脂滴呈紅色(圖1B)。

圖1 大鼠BMSCs的成骨、成脂誘導(dǎo)分化A.成骨誘導(dǎo)分化茜素紅染色結(jié)果；B.成脂誘導(dǎo)分化油紅O染色結(jié)果

2.外泌體的鑒定：提取的BMSC-Exo在透射電鏡下呈圓形或橢圓形，有完整的胞膜結(jié)構(gòu)，直徑主要集中于40～80nm(圖2A)；經(jīng)Western blot法檢測其表面特異性標(biāo)志物CD63、CD81、Tsg101表達(dá)呈陽性(圖2B)。

圖2 大鼠BMSC-Exo的鑒定A.透射電鏡下的外泌體；B.Western blot法檢測外泌體表面標(biāo)志物蛋白表達(dá)

3.BMSC-Exo對軟骨細(xì)胞遷移的影響：細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果如圖3所示，BMSC-Exo可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞劃痕的愈合，且隨著BMSC-Exo濃度增加和作用時間延長，愈合速度明顯加快(圖3A、B，P<0.05)。濃度為100μg/ml的BMSC-Exo作用24h時，劃痕愈合率達(dá)93.46%±2.58%，已幾乎完全愈合。加入IL-1β(10ng/ml)后，與對應(yīng)濃度的BMSC-Exo組比較，軟骨細(xì)胞的愈合速度減慢，IL-1β+Exo-100μg/ml組作用24h時，劃痕愈合率僅83.48%±0.50%。但是，與IL-1β對照組比較，BMSC-Exo處理可以減弱IL-1β對軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用(圖3C、D，P<0.01)。

4.BMSC-Exo對軟骨細(xì)胞增殖的影響：CCK-8法檢測細(xì)胞增殖的實驗結(jié)果如圖4所示，BMSC-Exo可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖活力，且呈時間和劑量依賴性(P<0.01)；IL-1β(10ng/ml)刺激會抑制軟骨細(xì)胞的增殖，而BMSC-Exo的存在可減弱IL-1β的抑制作用(P<0.05)。

5.BMSC-Exo對軟骨細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞術(shù)檢測軟骨細(xì)胞凋亡的實驗結(jié)果如圖5所示，隨著BMSC-Exo濃度增高和作用時間延長，軟骨細(xì)胞的凋亡比例逐漸降低(P<0.01)，加入IL-1β(10ng/ml)可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡， 但同時加入BMSC-Exo可顯著抑制IL-1β的促凋亡作用(P<0.01)。

討 論

OA嚴(yán)重影響患者的健康和生活，并會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。OA的治療一直是臨床難點，至今仍無預(yù)防、改善或是逆轉(zhuǎn)OA病程的有效途徑[1]。MSC組織工程為OA的治療帶來了新的曙光。

圖3 BMSC-Exo對軟骨細(xì)胞遷移的影響(×100)A、C.細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果；B、D.劃痕愈合率統(tǒng)計分析結(jié)果；與CM組或IL-1β組比較，*P<0.05，**P<0.01

MSC屬多功能干細(xì)胞，存在于骨髓、脂肪等多種組織，具有促生長、抗凋亡、抗炎和免疫抑制等功能，并有來源廣、易獲取、多向分化等特性，廣泛應(yīng)用于再生細(xì)胞治療領(lǐng)域，特別是OA這種退行性疾病[2]。自20世紀(jì)90年代起，大量的臨床研究證實直接關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSCs或?qū)⒑蠱SC的材料植入體內(nèi)，均可有效治療輕度至中度OA的軟骨缺損，產(chǎn)生透明樣軟骨，減輕患者疼痛，提高生活質(zhì)量[2～12]。盡管應(yīng)用MSC治療OA具有損傷小、見效快、療效好等優(yōu)點，但該方法花費巨大且存在醫(yī)學(xué)倫理學(xué)爭議、患者體重限制、有惡性轉(zhuǎn)化風(fēng)險等諸多限制因素，使得其臨床應(yīng)用受到局限。

圖4 BMSC-Exo對軟骨細(xì)胞增殖的影響與CM組或IL-1β組比較，*P<0.05，**P<0.01

近年來，大量研究證實MSC的治療效果主要來自于其旁分泌功能[2～4]。Exosome是一種重要的細(xì)胞旁分泌效應(yīng)成分，屬于細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)的一種，經(jīng)由內(nèi)體途徑產(chǎn)生，幾乎所有細(xì)胞都可分泌[13]。Exosome直徑30～100nm，由磷脂雙分子層和其內(nèi)包裹的脂類、蛋白質(zhì)、核酸等生物信息物質(zhì)構(gòu)成，在細(xì)胞間信息傳遞中發(fā)揮重要作用[13]。研究證實，MSC-Exo具有與其來源親本干細(xì)胞類似的功能[4,13]，在心肌梗死以及腦、肺、肝臟和急性腎損傷等疾病的動物模型中均可發(fā)揮良好的損傷修復(fù)效果[5，13]。最新研究結(jié)果顯示，基于MSC-Exo的抗炎和促生長作用，其可促進(jìn)OA關(guān)節(jié)軟骨再生，但相關(guān)機(jī)制尚有待于深入研究[6～9]。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)唯一的細(xì)胞成分，目前有關(guān)MSC-Exo對軟骨細(xì)胞作用效果的研究較少。

圖5 BMSC-Exo對軟骨細(xì)胞凋亡的影響A.流式細(xì)胞術(shù)實驗結(jié)果；B.細(xì)胞凋亡比例統(tǒng)計分析結(jié)果;與CM組或IL-1β組比較，**P<0.01

本研究采用超速離心結(jié)合超濾濃縮法成功提取BMSC-Exo。使用濃度梯度的BMSC-Exo處理軟骨細(xì)胞，結(jié)果表明BMSC-Exo可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的遷移和增殖，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，且這些作用效果均存在明顯的時間和劑量依賴性。Zhu等[14]曾證實，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和滑膜干細(xì)胞分泌的外泌體均可刺激軟骨細(xì)胞的遷移和增殖。Zhang等[15]的研究結(jié)果顯示，MSC-Exo在軟骨修復(fù)過程中可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并且推測AKT/ERK等多條信號通路可能參與調(diào)控該過程。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，并且更全面系統(tǒng)地闡述了BMSC-Exo作用效果與時間和劑量的相關(guān)性，但是相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。研究證實，Wnt/β-catenin信號通路在多種組織和細(xì)胞內(nèi)可參與調(diào)控細(xì)胞遷移、增殖及凋亡[16,17]。因此，下一步實驗中筆者將重點探索Wnt/β-catenin通路是否參與MSC-Exo調(diào)控軟骨細(xì)胞遷移、增殖和凋亡的過程。

OA患者的軟骨可自發(fā)產(chǎn)生大量的自分泌型IL-1β，而在正常軟骨中檢測不到。IL-1β(10ng/ml)是公認(rèn)的OA體外模型誘導(dǎo)劑，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退化[10,11]。本研究使用IL-1β(10ng/ml)刺激軟骨細(xì)胞以模擬OA病理環(huán)境，與既往研究者的結(jié)果類似，IL-1β可顯著抑制軟骨細(xì)胞的遷移和增殖，同時存在促凋亡作用[18,19]。本研究結(jié)果顯示，加入BMSC-Exo可有效減弱甚至逆轉(zhuǎn)IL-1β對軟骨細(xì)胞遷移、增殖和凋亡的影響，但深入機(jī)制還有待于后續(xù)實驗進(jìn)一步研究。Liu等[20]的最新研究結(jié)果同樣表明，MSC-Exo可減弱IL-1β產(chǎn)生的抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，并且lncRNA-KLF3-AS1/miR-206/GIT1軸參與調(diào)控該過程。

綜上所述，本研究證實BMSC-Exo存在與其來源親本干細(xì)胞類似的作用效果，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的遷移運動和增殖能力，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，可對軟骨細(xì)胞的生長發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究為探索外泌體修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為新型“無細(xì)胞”治療方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為OA的臨床防治提供更為廣闊的思路。